Татьяна омельченко: фильмография, фото, биография. , Переводчик.

Зарегистрироваться с Apple

β-Pix управляет коллективной миграцией клеток передней висцеральной энтодермы в раннем эмбрионе мыши

1. org/Person»> Татьяна Омельченко ¹ ,
2. М.Анхелес Рабадан ¹ ,
3. Росио Эрнандес-Мартинес ² ,
4. Хоаким Грего-Бесса ² ,
5. Кэтрин В. Андерсон ² и
6. Алан Холл ¹

1. ¹ Программа клеточной биологии,
2. ² Программа биологии развития, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10065, США

1. Авторы для переписки: omelchet mskcc. org, halla {at} mskcc.org

Аннотация

Коллективная миграция эпителия важна на протяжении всего эмбрионального развития. Основные механизмы плохо изучены но, вероятно, включает пространственно локализованную активацию Rho GTPases. Ранее мы сообщали, что Rac1 необходим для генерации протрузивная активность, которая управляет коллективной миграцией клеток передней висцеральной энтодермы (AVE) у ранних мышей эмбрион.Чтобы идентифицировать потенциальные регуляторы Rac1, мы сначала выполнили РНКи-скрининг факторов обмена семейства Rho (гуанин фактор обмена нуклеотидов [GEF]) в анализе коллективной миграции эпителия in vitro и идентифицировал β-Pix. Генетическое удаление β-Pix у мышей нарушает коллективную миграцию AVE, тогда как визуализация в реальном времени с высоким разрешением показала, что это связано со случайным направленная протрузивная активность. Мы пришли к выводу, что β-Pix контролирует пространственную локализацию активности Rac1, чтобы управлять коллективным Миграция AVE на критическом этапе развития мышей.

• Поступила 19.08.2014.
• Принята к печати 29 октября 2014 г.

Биолог развития Кэтрин Андерсон умерла в возрасте 68

Кэтрин Андерсон, биолог развития из Мемориального онкологического центра им. Слоуна Кеттеринга, известная своей работой по детализации генетики раннего эмбриогенеза, умерла 30 ноября в возрасте 68 лет.

На протяжении всей своей научной карьеры Андерсон использовала строгие генетические анализы для выявления мутаций, подозреваемых в нарушении деления и дифференцировки клеток в модельных системах. Выявив интересующий ген, она затем обратилась к методике, известной как прямая генетика, создавая модельные организмы, такие как дрозофилы и мыши с определенным фенотипом, чтобы лучше понять его молекулярную основу. Используя эти инструменты, Андерсон внес важный вклад в понимание учеными нескольких генетических путей, в первую очередь путей Toll и Hedgehog, необходимых для правильного развития этих животных.

«Кэтрин была бесстрашной и очень непредубежденной», — говорит The Scientist Татьяна Омельченко, старший научный сотрудник лаборатории Андерсона, которая использует конфокальную микроскопию для получения изображений эмбрионов мыши в реальном времени. «В каждой лаборатории своя среда и свое настроение, и, войдя в лабораторию Кэтрин, вы сразу почувствовали себя очень сосредоточенными».

Андерсон родилась в Ла-Хойе, Калифорния, в 1952 году. Она заинтересовалась наукой в ​​юном возрасте, благодаря статье в LIFE , которая включала подробное изображение человеческого зародыша, согласно интервью, опубликованному вскоре после ее смерти. .Она училась в Калифорнийском университете в Беркли, где получила степень бакалавра биохимии, прежде чем отправиться в аспирантуру по нейроразвитию в Стэнфордском университете в 1973 году.

Андерсон покинул эту программу всего через два года, получив степень магистра нейробиологии, следующие несколько лет провела в поисках своей научной ниши. Она на короткое время поступила в медицинский институт Калифорнийского университета в Сан-Диего, и этот опыт помог ей реализовать свою любовь к фундаментальным исследованиям.«Клиническая работа была не для меня», — поделился Андерсон в биографии 2005 года. «В лаборатории я чувствовал себя как дома».

В конце концов, Андерсон приземлился в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе, где изучал генетику развития Drosophila под руководством биолога Джудит Ленджел. В своей кандидатской работе Андерсон показала, что в первые два часа после оплодотворения развитие эмбрионов Drosophila остается под материнским контролем, а материнская РНК и белки управляют делением и дифференцировкой клеток внутри яйца.

В поисках дальнейшего изучения плодовых мух Андерсон поехала в Институт биологии развития Макса Планка в Германии в качестве постдока для работы с генетиком Drosophila Кристиан Нюсслейн-Фольхард. В 1995 году Нюсслейн-Фольхард разделила Нобелевскую премию за свою работу, используя массовые скрининги для выявления мутаций, нарушающих эмбриональное развитие, а Андерсон продолжала изучать несколько генов, идентифицированных на этих ранних скринингах, на протяжении всей своей карьеры.

Один из таких генов, известный как Toll , как оказалось, играет важную роль в дорсально-вентральной (D-V) дифференцировке, определяя, как Андерсон сказала в своей биографии, как эмбрион мухи «узнает свою спину от своего живота».В дополнение к исследованию функции Toll, Anderson продолжила строительство более широкой дороги Toll после возвращения в Калифорнийский университет в Беркли в качестве доцента в 1985 году, а затем в свою собственную лабораторию в Институте Слоана Кеттеринга, который она была запущена в 1996 году в Мемориале Слоан Кеттеринг. За это время Андерсон и ее команда идентифицировали около дюжины генов, участвующих в дифференцировке клеток по оси D-V, и она использовала аналогичные методы скрининга, чтобы лучше понять роль Толля в врожденном иммунитете Drosophila .Ее находки были отмечены генетиками Жюлем Хоффманном и Брюсом Бейтлером, чье исследование Toll-подобных рецепторов как у плодовой мухи, так и у иммунитета млекопитающих позже принесло им Нобелевскую премию.

Кэтрин Андерсон

Онкологический центр Мемориал Слоан-Кеттеринг

После своих успехов с плодовыми мушками Андерсон начала думать о применении тех же методов для изучения мышей. Она провела год в творческом отпуске в лаборатории Розы Беддингтон в Национальном институте медицинских исследований в Великобритании, где она показала, что Толл не играет аналогичной роли в дифференцировке D-V млекопитающих.Это продемонстрировало, как она сказала в интервью 2016 года для Development , что «есть вещи в раннем развитии млекопитающих, которые вы не можете понять, экстраполируя с мух».

Вернувшись в Институт Слоуна-Кеттеринга, Андерсон снова начал использовать массовые генетические исследования, на этот раз для выявления представляющих интерес мутаций у мышей, а затем изучил их до мельчайших деталей. Это были длительные эксперименты, на получение результатов которых часто уходили годы. «Я думаю, что ее главный вклад — это открытие функций и ролей генов через этот мутагенез», — говорит Омельченко.«Это потрясающе, потому что. . . модель эмбриона мыши довольно сложна, но она сделала всю работу ».

Андерсон и ее команда проверили более 12 000 мутаций, отобрав примерно 40, которые вызывают очевидные фенотипические нарушения в середине беременности. Усердно работая на протяжении многих лет, Андерсон выявил ранее неизвестные пути, которые с тех пор открыли новые направления исследований в области биологии развития.

Путем своего скрининга, например, Андерсон определила ранее неизвестную связь между ресничками — микроскопическими, похожими на волосы структурами на внешней стороне некоторых клеток — и надлежащей передачей сигналов пути Hedgehog, который диктует дифференцировку клеток в эмбрионах млекопитающих. Дальнейшие исследования показали, что компоненты этого пути обогащены ресничками, в то время как мыши с определенными мутациями в генах, участвующих в передаче сигналов Hedgehog, вообще лишены ресничек в структуре, называемой узлом, который управляет гаструляцией у эмбрионов позвоночных. «На самом деле это оказалось довольно удивительно: вся эта органелла необходима для передачи сигналов Hedgehog у позвоночных, но не у мух», — сказала Андерсон в своем интервью Development . «Это мечта генетика, но возникает вопрос, зачем организовывать геном таким образом: в передаче сигналов Hedgehog так много слабых мест, а Hedgehog жизненно важен.

За свой вклад в область биологии развития Андерсон была принята в Национальную академию наук в 2002 году и избрана членом Института медицины национальных академий в 2008 году. Кроме того, она была награждена премией Томаса Ханта. Медаль Моргана за пожизненный вклад в науку генетики в 2012 году, Федерация американских обществ за выдающиеся достижения в области науки экспериментальной биологии в 2014 году и Эдвин Дж. Общество биологии развития.Медаль Конклина за выдающиеся и постоянные исследования в 2016 году, среди прочих наград.

Перед своей смертью Андерсон говорила о возможном расширении своих исследований в области генетики человека, поскольку с тех пор нарушения передачи сигналов hedgehog были связаны как с врожденными дефектами, так и с рядом заболеваний, называемых цилиопатиями. Однако это была линия вопросов, которую она планировала оставить другим ученым, довольствуясь продолжением своей методической работы по изучению мутаций у мышей.

«Многие ученые — очень тихие люди, но современное общество требует, чтобы вы были очень громкими, чтобы люди вас слушали», — говорит Омельченко.«Кэтрин — отличный пример того, как вести себя тихо, быть очень глубоким мыслителем и в то же время стать очень успешным и ярким ученым. Думаю, я буду продолжать учиться у нее, даже если она скончалась ».

У Андерсон остался муж, Тимоти Бестор, генетик из Колумбийского университета.

Супрессор опухолей PTEN и киназа PDK1 регулируют образование столбчатого нервного эпителия

Эмбрионы мышей, у которых отсутствует PTEN, имеют беспрецедентный дефект морфогенеза нервной трубки. У мутантных эмбрионов Pten образуется нейральный эпителий SOX2 +, который обнаруживает нормальную сегрегацию апикальных и базальных маркеров, формируется с помощью сигналов развития и нормально размножается. Однако мутантный головной нейральный эпителий не может претерпевать переход от кубовидного к высокому столбчатому псевдостратифицированному эпителию; вместо этого мутантная нервная пластинка тонкая, широкая и нерегулярно сложенная, а закрытие головной нервной трубки полностью не удается.

Фосфоинозитиды были описаны как ключевые регуляторы апикально-базальной полярности (Martin-Belmonte et al., 2007; Shewan et al., 2011), и действительно, мутанты Pten имеют глубокий дефект в организации третьего (апикально-базального) измерения нервного эпителия. Однако традиционные маркеры апикально-базальной полярности правильно локализованы в нервной пластинке мутанта Pten : Par3, aPKC, ZO1, P-ERM, N-кадгерин и F-актин локализуются апикально, а ламинин локализуется базально. На основании обогащения pAKT как апикальной, так и базолатеральной мембран мутантной нервной пластинки Pten , маркеры апикально-базальной полярности локализованы правильно, несмотря на высокие уровни PtdIns (3,4,5) P ₃ во всех клеточных мембранах.

Несмотря на важную роль фосфоинозитидов в передаче сигналов mTOR, эндоцитарной сортировке, рециклинге и торговле (Di Paolo and De Camilli, 2006; Shewan et al., 2011; Dibble and Cantley, 2015), генетические и химико-генетические данные демонстрируют, что все фенотипы в нервной пластинке Pten опосредованы повышенной активностью PDPK1. Хотя фосфорилированный AKT обогащен всеми клеточными мембранами в мутантной нервной пластинке, ингибирование нижележащих киназ AKT или mTor не изменяет фенотип мутанта Pten , тогда как удаление Pdpk1 спасает все аспекты фенотипа Pten .Таким образом, мы делаем вывод, что именно несоответствующая PtdIns (3,4,5) P ₃ -стимулируемая активность PDPK1, а не изменения уровней других фосфоинозитидов или активности AKT или mTorc1, опосредуют все наблюдаемые морфогенетические дефекты. в мутантном нервном эпителии Pten .

Возможно, наиболее разительным клеточным различием между Pten и клетками нервной пластинки дикого типа является отсутствие стабильных апикально-базальных массивов микротрубочек у мутанта. Формирование нецентросомных наборов апикобазальных микротрубочек с апикальными минус-концами и базальными плюс-концами является отличительной чертой столбчатого эпителия (Bré et al., 1987; Яулин и Крейцер, 2010). В соответствии с требованием массивов микротрубочек для апикально-базального переноса столбчатого эпителия (Jaulin and Kreitzer, 2010; Rodriguez-Boulan and Macara, 2014), базальный транспорт апикально эндоцитозированного трансферрина не работает в нервной пластинке Pten . Недавняя работа показала, что PTEN может напрямую связываться с пузырьками, ассоциированными с микротрубочками (Naguib et al., 2015), указывая тем самым, что PTEN может играть прямую роль в перемещении от апикального к базальному направлениям в нервной пластинке. Данные показывают, что PTEN необходим для организации стабильных массивов апикально-базально ориентированных микротрубочек, которые могут как стабилизировать длинную ось клетки, так и способствовать перераспределению мембраны от апикальных к базолатеральным доменам нейроэпителиальных клеток, что приводит к переход от кубовидного эпителия к столбчатому.

На той же стадии (между E8.0 и E8.5), когда нервные клетки дикого типа начинают удлиняться и образовывать массивы апикально-базальных стабильных микротрубочек, клетки нервной пластинки также реорганизуются в плоскости эпителия, чтобы стать более гексагонально упакованы.На E8.0 упаковка клеток как в передней нервной пластинке дикого типа, так и у мутанта Pten является нерегулярной и включает в себя расположение, подобное розетке, которое является признаком динамического эпителия (Blankenship et al., 2006). К ст. E8.5 клетки дикого типа превратились в более регулярный паттерн упаковки, и наблюдается меньшее количество розеток, тогда как нервная пластинка Pten продолжает иметь много расположений клеток, подобных розеткам.

Pten-зависимые, не зависящие от Akt изменения в упаковке клеток также наблюдались в крыловом диске Drosophila , где эффект мутации Pten был приписан дефектам ремоделирования спаек (Bardet et al., 2013). Подобно тому, что мы наблюдали в головной нервной пластинке мыши, мутант Pten , эпителиальные клетки диска крыла мутанта Drosophila Pten имеют меньше соседей, чем видно в регулярном гексагональном массиве. В случае Drosophila высокие уровни миозина-II преимущественно наблюдаются на коротких краях мутантных клеток Pten . Напротив, миозин-II анизотропно распределен как в нервной пластинке мыши дикого типа, так и в мутантной E8.0 мыши, и он может быть обогащен как на длинных, так и на коротких краях клеток.Анизотропное распределение миозина-II сохраняется в мутанте E8.5 Pten , в то время как миозин-II становится обогащенным по всем краям клеток нервной пластинки дикого типа E8.5, вероятно, в рамках подготовки к следующей фазе закрытия нервной трубки. , опосредованное актомиозином апикальное сужение. Таким образом, потеря PTEN блокирует созревание упаковки клеток в нервной пластинке, но нет простой взаимосвязи между фенотипом Pten и распределением миозина-II.

Аномальная плоская упаковка клеток и отсутствие апикально-базальных массивов микротрубочек в нервной пластинке Pten , по-видимому, связаны: они возникают одновременно, и оба зависят от регулируемой активности PDPK1.Связь этих двух фенотипов согласуется с известными связями между апикальными соединениями и массивами микротрубочек. Соединения апикальных сращений являются сайтами закрепления нецентросомных массивов микротрубочек (Meng et al., 2008; Gavilan et al., 2015). Динамика микротрубочек, в свою очередь, может регулировать стабильность слипчивых соединений (Meng et al., 2008; Waterman-Storer et al., 2000), подтверждая существование петли положительной обратной связи, которая соединяет стабильные слипчивые соединения и массивы микротрубочек. Мы предполагаем, что мишень PDPK1 в мутантной нервной пластинке Pten ингибирует стабилизацию апикальных соединений, что, в свою очередь, блокирует образование нецентросомных массивов микротрубочек, необходимых для удлинения клеток в нервной пластинке (рис. 8).Прямая цель PDPK1 в этом процессе неизвестна; одна возможность состоит в том, что несоответствующая активность PDPK1 способствует динамическим колебаниям активности aPKC и / или PKN. PtdIns (3,4,5) P ₃ -связанная PDPK1 достаточна для активации этих двух классов киназ (Balendran et al., 2000), а aPKC может регулировать как апикальные соединения, так и организацию микротрубочек (Harris and Tepass, 2008; Harris и Пайфер, 2007).

Модель роли PTEN в формировании псевдостратифицированного столбчатого эпителия.

PDPK1 прикреплен к плазматической мембране с помощью PtdIns (3,4,5) P ₃ (PIP3), который продуцируется киназой PI3 (PI3K) и разрушается PTEN. У мутанта Pten увеличение PIP3 рекрутирует высокие уровни PDPK1 в мембрану, где он активируется. Активированная мембранно-ассоциированная PDPK1 имеет две цели: активированная PDPK1 генерирует высокие уровни pAKT; по отдельному пути высокие уровни ассоциированной с мембраной PDPK1 ингибируют образование стабильных апикальных соединений. Стабильные апикальные соединения необходимы для образования стабильных апикально-базальных массивов микротрубочек, которые обеспечивают перемещение от апикального к базальному нервному эпителию, обеспечивая удлинение и плотную упаковку клеток в нервном эпителии. У WT PDPK1 не требуется для образования псевдостратифицированного нервного эпителия, хотя задержка закрытия нервной трубки у мутантов Pdpk1 может отражать тонкую роль белка в организации эпителия.

PTEN выполняет множество ролей в развитии мозга млекопитающих, включая контроль размера клеток (Kwon et al., 2001), дифференцировку и миграцию нейронов (Yue et al., 2005), структуру синапсов и синаптическую пластичность (Fraser et al., 2008; Sperow et al., 2012) и регенерация аксонов (Park et al., 2008). Человеческие мутации в одной копии гена PTEN связаны с множеством аномалий в развитии мозга, включая мегалэнцефалию и фокальную корковую дисплазию, которые могут привести к аутизму и детской эпилепсии (Hevner, 2015; Jansen, et al. , 2015; Чжоу и Парада, 2012). Наши открытия определяют глубокую, очень раннюю роль PTEN в организации мозга, которая, вероятно, вносит вклад в синдромы человека, вызванные гаплонедостаточностью PTEN.

PDPK1-зависимые изменения эпителиальной стабильности также могут играть важную роль в опухолях, в которых отсутствует PTEN. Мутации в пути киназы PI3 чрезвычайно распространены в опухолях: например, почти 80% случаев карциномы эндометрия (не ультрамутантные образцы) имеют инактивирующие мутации в PTEN (Cancer Genome Atlas Research Network et al., 2013) и 45% опухолей молочной железы просвета A человека несут активирующие мутации в PIK3CA (Cancer Genome Atlas Network, 2012). Предыдущие исследования предоставили доказательства того, что независимость от закрепления и рост ксенотрансплантата клеток рака молочной железы, несущих активированный аллель h2047R PI3KCA , зависит от PDPK1, но не от AKT (Gagliardi et al., 2012), и фосфопротеомный анализ клеточных линий с активированными мутациями PI3KCA . случаи, когда активность PDPK1, но не активность AKT, требовалась для канцерогенности (Vasudevan et al., 2009). Представленные здесь данные демонстрируют, что PtdIns (3,4,5) P ₃ -зависимая активность PDPK1 является важным следствием отсутствия PTEN in vivo, даже в отсутствие активации AKT. Наши находки подчеркивают важность идентификации соответствующих мишеней PDPK1 во время развития мышей, при связанных с PTEN синдромах развития и в опухолях.

белок-супрессор опухоли LKB1 регулирует сборку актиновых филаментов через Rho и его фактор обмена Dbl независимо от киназной активности | BMC Molecular and Cell Biology

Экспрессия LKB1 вызывает образование стрессовых волокон в клетках HeLa-S3

Клетки HeLa-S3 содержат неопределяемые уровни эндогенного LKB1 [3].Чтобы определить, может ли LKB1 влиять на организацию актиновых филаментов, клетки HeLa-S3 временно трансфицировали плазмидой экспрессии LKB1. Как сообщалось ранее, LKB1 локализуется в ядре и в цитозоле (Fig. 1B). Через 24 часа после трансфекции диффузные тонкие актиновые филаменты, присутствующие в контрольных клетках (фиг. 1A), были реорганизованы с образованием параллельных стрессовых волокон, пересекающих тела клеток (фиг. 1C). Визуализация клеток с антителами против паксиллина показала, что контрольные клетки содержат преимущественно периферические очаговые комплексы (рис.2А, Б). Экспрессия LKB1 индуцирует более классические удлиненные фокальные адгезии, расположенные в теле клетки и связанные с концами пучков актиновых филаментов (Fig. 2C, D, E). Было обнаружено, что небольшая фракция LKB1 связана с плазматической мембраной (Fig. 2C).

Экспрессия LKB1 индуцирует сборку актиновых филаментов в клетках HeLa-S3 . Клетки HeLa-S3 трансфицировали различными меченными myc конструкциями LKB1, клонированными в плазмиду экспрессии pRK5. Клетки фиксировали и окрашивали анти-myc-антителом и флуоресцентным фаллоидином для визуализации нитчатого актина. А . Контрольные клетки, экспрессирующие пустой вектор pRK5-myc, отображали в основном кортикальные актиновые филаменты и несколько тонких актиновых филаментов по телам клеток. Б-Е . Экспрессия LKB1 дикого типа (B и C) или мертвой киназы (D194A), меченного myc (D и E), приводила к образованию актиновых филаментов в клетках HeLa-S3. Как LKB1 дикого типа, так и мертвые киназы LKB1 были обнаружены в ядре и в цитоплазме. F, G . С-конец LKB1 не индуцирует актиновые филаменты. Н . Доменная структура LKB1 и конструкции, использованные в статье.Указаны критические аминокислоты. Я . Количественная оценка влияния LKB1 на формирование актиновых волокон (стрессовых волокон). Экспрессирующие клетки оценивали по образованию стрессовых волокон (пучки актиновых филаментов через тела клеток). Масштабная линейка = 20 мкм.

LKB1 способствует образованию очаговой адгезии в клетках HeLa-S3 . А.Б. . Контрольные клетки HeLa-S3, окрашенные паксиллином, выявляют небольшие периферические очаговые комплексы, которые локализуются вместе с кортикальным актином. С-Е .Экспрессия LKB1, меченного myc, вызывает удлиненные очаговые адгезии по всему телу клетки, которые украшают концы вновь образованных стрессовых волокон. Фракция сверхэкспрессированного белка LKB1 присутствует на клеточной мембране. Масштабная линейка = 20 мкм.

Киназный домен LKB1 необходим для формирования стрессовых волокон и фокальной адгезии, но киназная активность отсутствует.1H). Две киназно-мертвые мутантные конструкции LKB1 (D194A и T189A) были способны индуцировать стрессовые волокна, а также LKB1 дикого типа (рис. 1D, E, I). Однако мутантные конструкции, лишенные киназного домена, утратили способность образовывать стрессовые волокна (рис. 1F, G, I). Конструкции, кодирующей только киназный домен LKB1 (KIN WT) или мертвый киназный домен киназы (KIN KD), было достаточно, чтобы способствовать образованию стрессовых волокон в клетках HeLa-S3 (рис.

Формирование стрессовых волокон требует RhoA

Rho GTPases являются важными регуляторами сборки актиновых филаментов, и их участие в LKB1-индуцированном образовании стрессовых волокон было изучено.Клетки HeLa-S3 трансфицировали пулами siRNA SMART, нацеленными на различных членов семейства Rho (RhoA, RhoB, RhoC, Rac1, Rac3 и Cdc42), и через 2 дня клетки повторно трансфицировали конструкцией экспрессии LKB1 дикого типа, меченной myc. Истощение RhoA предотвращало образование стрессовых волокон после экспрессии LKB1 (Fig. 3D, E), но истощение других Rho GTPases не имело эффекта (данные не показаны). Эффект истощения RhoA с помощью siRNA SMARTpool был подтвержден с использованием 4 отдельных дуплексов siRNA (рис. 3H), каждый из которых эффективно истощал уровни RhoA (рис.3I). Котрансфекция доминантно-негативной формы RhoA (GFP-N19RhoA) с LKB1 также блокировала образование стрессовых волокон (фиг. 4D-F), в то время как доминантно-негативная форма Cdc42 (GFP-N17Cdc42) не блокировала (фиг. 4A-C). ROCK (rho kinase) является важным эффектором RhoA, участвующим в формировании актиновых стрессовых волокон [16]. Клетки, экспрессирующие LKB1, обрабатывали ингибитором ROCK Y-27632 (10 мкМ) в течение 6 часов, и это полностью ингибировало образование стрессовых волокон, как ожидалось (данные не показаны). Эти эксперименты предполагают, что LKB1 индуцирует сборку актиновых филаментов посредством активации пути RhoA / ROCK и что это является прямым, а не через активацию Cdc42 или Rac.

Формирование стрессовых волокон опосредуется RhoA и Dbl . Клетки HeLa-S3 трансфицировали siRNA, а затем через 2 дня повторно трансфицировали LKB1 дикого типа, меченный myc. А . Клетки HeLa-S3 трансфицировали контрольной миРНК, а через 2 дня вводили пустой вектор. В, С . Клетки трансфицировали контрольной миРНК, а через 2 дня — конструкцией LKB1, меченной myc. D, E . Клетки, трансфицированные RhoA siRNA SMARTpool, с последующим введением через 2 дня конструкции LKB1 с myc-меткой. F, G . Клетки трансфицировали siRNA Dbl SMARTpool с последующим введением через 2 дня конструкции LKB1, меченной myc. Н . Количественная оценка образования стрессовых волокон. Четыре индивидуальных siRNA (1-4) и SMARTpool (sp) показаны для RhoA, а две отдельные siRNA (1,2) и SMARTpool (sp) показаны для Dbl. Я . Вестерн-блоттинг показывает эффективность отдельных миРНК в истощении эндогенных белков RhoA и Dbl. Лизаты клеток собирали через 3 дня после трансфекции миРНК. Масштабная линейка = 20 мкм.

Доминантно-отрицательный RhoA ингибирует образование стрессовых волокон . А-С . Клетки котрансфицировали конструкциями GFP-DN-Cdc42 (N17Cdc42) и pRK5-myc-LKB1. Д-Ф . Клетки котрансфицировали GFP-DN-RhoA (N19RhoA) и pRK5-myc-LKB1. Подсчитывали клетки, экспрессирующие как GFP, так и myc, и оценивали образование стрессовых волокон. Масштабная линейка = 20 мкм.

Экспрессия LKB1 приводит к активации RhoA

Чтобы определить, вызывает ли экспрессия LKB1 активацию (т. е.е. GTP-загрузка) Rho, a Rho. Анализ GTP-pulldown проводили на лизатах клеток HeLa-S3 с использованием слитого белка GST-rhotekin, присоединенного к агарозе. Экспрессия LKB1 дикого типа или киназно-мертвого LKB1 приводила к 3-4-кратному увеличению уровней RhoA.GTP по сравнению с контрольными клетками, тогда как экспрессия C-конца LKB1 не оказывала заметного эффекта (фиг. 5).

Экспрессия LKB1 активирует RhoA в клетках HeLa-S3 . Клетки трансфицировали различными конструкциями LKB1 и через 24 часа после трансфекции оставляли без сыворотки в течение 12 часов.Клетки собирали и активировали Rho. Уровни GTP определяли с помощью стандартного метода анализа. LKB1 дикого типа и мертвый киназный LKB1 (D194A) индуцируют 3-4-кратное увеличение уровней активного RhoA по сравнению с ложно-трансфицированными клетками, тогда как экспрессия С-концевого фрагмента LKB1 не имеет никакого эффекта.

Формирование стрессовых волокон требует фактора обмена Dbl

Факторы обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF) катализируют обмен GDP на GTP на Rho GTPases для активации конформационного переключателя. Описанные выше эксперименты повышают вероятность того, что LKB1 активирует GEF, специфичный для Rho [17]. Сообщается, что из 82 GEF, закодированных в геноме человека, 22 обладают активностью, специфичной для Rho (дополнительный файл 1). Клетки HeLa-S3 трансфицировали пулами siRNA SMART, нацеленными на каждый из этих GEF, и через два дня клетки повторно трансфицировали конструкцией экспрессии LKB1. Истощение одного GEF, Dbl, эффективно блокирует образование стрессовых волокон, индуцированное LKB1 (рис. 3F, G, H). Этот эффект был подтвержден с использованием двух индивидуальных дуплексов siRNA Dbl, оба из которых истощали эндогенный белок Dbl, судя по вестерн-блоттингу (рис.3Н, I).

Домен киназы LKB1 взаимодействует с доменом DH / PH Dbl

Белок Dbl состоит из нескольких распознаваемых доменов, включая домен DH из 200 остатков (гомология Dbl), примыкающий к домену PH из 100 остатков (гомология плекстрина) (рис. 6A) ). Этот мотив DH / PH отвечает за активность каталитического обмена нуклеотидов в GEF семейства Rho. Чтобы определить, может ли LKB1 взаимодействовать с Dbl, меченый myc полноразмерный LKB1 экспрессировали в клетках HeLa-S3 и иммунопреципитировали с помощью антитела против myc или контрольного антитела IgG.Вестерн-блоттинг с использованием антитела против Dbl выявил совместное осаждение эндогенного Dbl с LKB1 (фиг. 6B). Точно так же иммунопреципитация эндогенного Dbl анти-Dbl антителом приводила к совместной преципитации myc-меченного LKB1 (фиг. 6C). Затем различные конструкции LKB1, меченные myc, экспрессировали в клетках HeLa-S3 и проводили реакции иммунопреципитации с антителом против Dbl. Было обнаружено, что как LKB1 дикого типа, так и мертвые киназы LKB1 (D194A) одинаково хорошо со-преципитируют с эндогенным Dbl (рис.6D, дорожки 2 и 3), но конструкции LKB1, лишенные киназного домена, этого не сделали (фиг. 6D, дорожки 4 и 5).

LKB1 взаимодействует с эндогенным Dbl . А . Схематическое изображение прото-Dbl и конструкций, использованных в этой работе. Б . Клетки HeLa-S3, трансфицированные вектором (pRK5myc), или pRK5myc-LKB1 дикого типа. LKB1 иммунопреципитировали из клеточных лизатов с помощью антитела против myc (дорожки 1 и 3) или контрольного IgG (дорожка 2) и анализировали с помощью вестерн-блоттинга.Dbl обнаруживали с помощью антитела Dbl. Примерно 20% эндогенного Dbl было осаждено антителом myc. С . Клетки HeLa-S3, трансфицированные pRK5myc-LKB1. Лизаты клеток подвергали иммунопреципитации с использованием либо контрольного кроличьего IgG (дорожка 1), либо антитела против Dbl (дорожка 2). Две верхние панели представляют собой общие клеточные лизаты, обработанные анти-Dbl и анти-myc антителами. Две нижние панели представляют собой иммунопреципитаты Dbl и IgG, блотированные анти-Dbl и анти-myc антителами. Около 1% сверхэкспрессированного myc-LKB1 осаждали эндогенным Dbl с использованием анти-Dbl. Д . Клетки HeLa-S3, трансфицированные pRK5myc, или pRK5myc кДНК LKB1. Две нижние панели: эндогенный Dbl, иммунопреципитированный из клеточных лизатов анти-Dbl антителом, с последующим вестерн-блоттингом с использованием либо анти-myc, либо анти-Dbl антитела. Верхняя панель: экспрессия LKB1 в общих клеточных лизатах с использованием анти-myc. E . Конструкции Dbl экспрессируются в клетках HEK293T как слитые белки GST и очищаются с использованием глутатион-агарозы. К гранулам добавляли равные количества клеточного лизата, выделенного из клеток, экспрессирующих pRK5myc-LKB1 дикого типа, и LKB1, связанный с гранулами, определяли с помощью вестерн-блот-анализа с использованием антитела против myc (нижняя панель).GST-Dbl и LKB1 были обнаружены с помощью антител против GST и против myc соответственно.

Для идентификации области Dbl, необходимой для взаимодействия с LKB1, различные конструкции Dbl (T1, onco-Dbl, N-Dbl, см. Фиг. 6A) были экспрессированы в клетках HEK293T в виде слитых белков GST. Белки очищали из клеточных лизатов с использованием гранул глутатион-агарозы. Затем равное количество шариков инкубировали с лизатами, полученными из клеток HeLa-S3, экспрессирующих myc-tagged LKB1 дикого типа. LKB1 эффективно захватывается конструкциями Dbl, содержащими домены DH / PH (рис. 6E, T1 и onco-Dbl), но не конструкциями, содержащими только N-концевые регуляторные последовательности (фиг. 6E, N-Dbl). Мы заключаем, что LKB1 взаимодействует с областью DH / PH Dbl.

Коэкспрессия LKB1 с STRAD приводит к образованию актиновой точки

Адаптерный белок LKB1 STRAD облегчает ядерный экспорт LKB1 и необходим для полной активности [10]. Чтобы определить эффект сверхэкспрессии STRAD, экспрессирующие конструкции LKB1, меченные myc, и STRAD, меченные Xpress, котрансфицировали в клетки HeLa-S3.В цитозоле котрансфицированных клеток было обнаружено значительно больше LKB1, чем в клетках, трансфицированных одним LKB1 (сравните фиг. 7, панели 1 и 2 и фиг. 1B). Кроме того, филаменты актина сливаются с образованием точек (фиг. 7, панели 3 и 4), которые связаны с фосфорилированным эзрином (фиг. 7, панели 3-5). Совместная экспрессия STRAD с конструкцией мертвого LKB1 киназы D194A продуцировала аналогичные актиновые точки (данные не показаны). Интересно, что эзрин / актиновые точки локализуются на дорсальной поверхности трансфицированных клеток (рис. 7, панели 6-8 и z-разрез в панели 9).

Ко-трансфекция LKB1 и STRAD приводит к актиновой точке, связанной с фосфоэзрином . Панели 1 и 2 : Клетки HeLa-S3 трансфицировали myc-LKB1 и pcDNA-HisMax-STRAD. Клетки окрашивали анти-myc или анти-Xpress антителами. LKB1 частично перемещается в цитозоль после экспрессии STRAD. Панели 3-5 : Клетки трансфицировали myc-LKB1 и pcDNA-HisMax-STRAD и визуализировали с помощью антитела против myc, антитела против фосфоэзрина и фаллоидина для визуализации актина.Фосфорилированный эзрин связан с актиновыми точками в трансфицированных клетках. Панели 6-8 : клетки трансфицировали myc-LKB1 и pcDNA-HisMax-STRAD и визуализировали с помощью антитела против myc и антитела против фосфоэзрина. Базальный уровень фосфорилированного эзрина можно увидеть в нетрансфицированных клетках (белые стрелки, панель 7) . Панель 9 : изображение в Z-сечении клеток на панели 7, показывающее точки фосфорилированного эзрина, присутствующие на дорсальной поверхности. Масштабная линейка = 20 мкм.

Как оставаться счастливым и продуктивным во время учебы в трудные времена

Будьте избирательны

Столкнувшись с многочисленными возможностями в университете, возникает соблазн просто сказать «да» всему и сделать все.Мы также можем почувствовать необходимость заполнить наш график из-за дополнительного времени, полученного из-за блокировки. Как человек, движимый смыслом и ценностями, я (Глория) считаю, что в личном росте качество всегда побеждает количество. Избирательность позволит вам участвовать и вносить свой вклад в более значимую работу и, в свою очередь, влияет на то, сколько вы извлекаете из этого опыта.

«« Речь идет о пути, а не о пункте назначения »

Планируйте и используйте приложения для повышения производительности, чтобы не терять концентрацию

Наличие списка дел позволяет мне разбивать большие задачи на более управляемые.Написание эссе на 1500 слов кажется менее сложным, если разделить его на небольшие обязанности. Это также позволяет вам визуализировать, что вам нужно сделать за этот день, и получать это удовлетворение, когда вы вычеркиваете что-то из своего списка.

Исследование также показало, что люди с большей вероятностью будут считать себя ответственными и выполнять взятые на себя обязательства, когда они записывают их. Я (Стефани) обнаружила, что ведение списка даже с самыми мелкими задачами, например, выбрасывание мусора, подталкивает меня делать то, что мне нужно.К концу дня я чувствую себя выполненным, потому что понимаю, что все эти мелочи собраны в продуктивный день.

Еще одна техника обучения, которую я определенно рекомендую, — это техника помидора. Это работает так: вы выполняете 25-минутный цикл непрерывной работы, за которым следует короткий 5-минутный перерыв, а затем снова возвращаетесь к работе. Использование техники Помидора помогло мне понять, сколь многого я могу достичь за короткое время, если я буду полностью сосредоточен.Есть много приложений-таймеров Pomodoro, таких как Focus City, Focus Keeper и Emphasis, но мне больше всего нравится Flora. С Flora растение будет расти каждые 25 минут, когда вы остаетесь сосредоточенными.

Тем, кто пытается продуктивно работать в одиночку, я предлагаю посмотреть видео «Учись со мной» на YouTube. Их эстетические видео состоят из того, как они работают и продуктивны, что мотивирует меня, потому что заставляет меня чувствовать, что я много работаю с кем-то другим. На YouTube есть широкий выбор этих видео «Учитесь со мной», так что вы можете выбрать все, что вам больше нравится: будь то видео со звуками карандаша ASMR, фоновым шумом в кафе или даже потоковой передачей в реальном времени.

Будьте добры к себе!

Наконец, мы должны быть добры к себе. Как говорится в каждом письме и заголовке: мы живем в беспрецедентные времена. Легко запутаться из-за крайних сроков выполнения заданий и писем с отказами, но в конечном итоге мы все должны найти время, чтобы оглянуться назад и посмотреть, сколько мы уже достигли. Вам не обязательно быть продуктивным 24/7. Если вы устали, вздремните и отдохните. Не будьте так строги к себе, если не можете отметить все, что вам нужно.Вы уже стараетесь изо всех сил, и этого более чем достаточно.

Если вам когда-нибудь понадобится дополнительная помощь, у Imperial есть множество услуг, на которые вам стоит обратить внимание. Служба консультирования студентов и психического здоровья проводит предстоящие семинары по таким темам, как хороший сон, прокрастинация и управление стрессом, которые можно найти здесь. Команда также публикует еженедельные видеоролики и ресурсы в серии Kind Mind, в которых основное внимание уделяется таким важным вопросам, как преодоление карантина, преодоление стресса и беспокойства и повышение устойчивости; все они доступны здесь.. Кроме того, если вы чувствуете, что вам нужен кто-то, с кем можно поговорить, Imperial предлагает консультационную поддержку. , о котором вы можете договориться по этой ссылке.

Спасибо за внимание, мы надеемся, что эти советы помогут вам учиться и обрести счастье в эти непредсказуемые времена.