Шувалова екатерина: Шувалова Екатерина Алексеевна — 14 отзывов | Рязань

HEK 293T выращивали в 15 см чашке до примерно 70% конфлюэнтности.Перед лизисом клетки выращивали еще 15 мин в присутствии 100 мкг / мл циклогексимида. Затем клетки лизировали в 400 мкл ледяного буфера для лизиса полисомов (20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 250 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl ₂ , 1 мМ DTT, 0,5% Triton X-100, 100 мкг / мл. циклогексимид) и центрифугировали 20 мин при 16000 g при 4 ° C. Супернатант загружали в линейный 12 мл градиент 10-60% (мас. / Об.) Сахарозы (20 мМ Трис-HCl pH 7,5, 250 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl ₂ , 1 мМ DTT, 10% и 60% сахароза).Образцы центрифугировали при 40 000 об / мин с использованием ротора SW40 (Beckman) при 4 ° C в течение 90 мин, а затем фракционировали на фракции по 600 мкл с непрерывным контролем оптической плотности при 260 нм. Каждую фракцию осаждали 10% (мас. / Об.) Трихлоруксусной кислотой. Полученный осадок сушили и, наконец, ресуспендировали в 50 мкл буфера для образцов SDS. Образцы разделяли на 10% SDS-PAGE и анализировали вестерн-блоттингом с использованием различных антител. Для вестерн-блоттинга для обнаружения использовали антитела против RPS15, анти-RPL15, анти-eRF1, анти-DDX19B (Abcam).

Рибосомные субъединицы и факторы трансляции

Рибосомные субъединицы 40S и 60S, а также факторы трансляции эукариот eIF2, eIF3, eEF1H и eEF2 были очищены из лизата ретикулоцитов кролика, как описано (22). Факторы трансляции человека eIF1, eIF1A, eIF4A, eIF4B, ΔeIF4G, ΔeIF5B, eIF5, DDX19A, DDX19B, мутанты DDX19B, wt eRF1, мутанты eRF1 (eRF1 (AGQ), eRF1 без концевого домена eRF3) и eRF1 (K83N-c) и (138 аминокислотных остатков) были получены в виде рекомбинантных белков в E.coli , штамм BL21 и впоследствии очищенный с помощью Ni-NTA агарозы и ионообменной хроматографии (22). Человеческий полноразмерный eRF3a (GSPT1) был любезно предоставлен доктором Christiane Schaffitzel. Его клонировали в вектор pFastBac-Htb (Life Technolgies) и экспрессировали в клетках насекомых Sf21 с использованием бакуловируса EMBacY из системы экспрессии MultiBac (34). Гидроксилированная форма человеческого eRF1 (eRF1-OH), экспрессируемая в E. coli (35), была любезно предоставлена ​​доктором Мэтью Колеманом.

С использованием РНК-полимеразы Т7 мРНК in vitro транскрибировали из плазмиды MVHL-stop, которая содержит промотор Т7, четыре повтора CAA, 5′-нетранслируемую область β-глобина, открытую рамку считывания (кодирующую пептид MVHL), за которым следует стоп-кодон UAA и 3′-нетранслируемая область, содержащая остальную часть кодирующей последовательности природного β-глобина (36). Для последующей транскрипции плазмиду MVHL-stop линеаризовали рестрикционным гидролизом с помощью XhoI .

Сборка рибосомных комплексов

Инициаторные комплексы были собраны в 30 мкл при 0 ° C и содержали 2 пмоль мРНК, 6 пмоль Met-тРНК _i ^Met , 4,5 пмоль 40S и 60S субъединиц рибосомы, 7,5 пмоль eIF2, eIF3, eIF4A, ΔeIF4G, eIF4B, eIF1, eIF1A, eIF5, ΔeIF5B каждый, с добавлением буфера, состоящего из 20 мМ трис ацетата, pH 7.5, 100 мМ KAc, 2,5 мМ MgCl ₂ , 2 мМ DTT, 0,3 Ед / мкл ингибитора РНКазы, 1 мМ АТФ, 0,25 мМ спермидин, 0,2 мМ GTP. Реакционную смесь выдерживали при 37 ° C в течение 15 минут для образования комплекса рибосома-мРНК, а затем 10 мкл образца применяли в анализе отпечатков пальцев.

Пептидное удлинение выполняли в 20 мкл путем добавления 3 пмоль общей тРНК (ацилированной всеми или отдельными аминокислотами), 8 пмоль eEF1H и 2 пмоль eEF2 к инициирующему комплексу и инкубировали в течение 15 мин при 37 ° C. Затем 10 мкл образца, содержащего preTC, применяли в анализе отпечатка пальца.

К последним 10 мкл образца, содержащему preTC, добавляли 5 пмоль eRF1 и 5 пмоль eRF3a / c. Реакционную смесь инкубировали при 37 ° C в течение 15 минут и затем использовали в анализе отпечатков пальцев.

Анализы сборки и терминации очищенных preTCs

Препаративное количество преТС было собрано in vitro , как описано (37), и использовано в анализе высвобождения пептидов и анализе конформационной перегруппировки (38).Вкратце, 37 пмоль мРНК инкубировали в течение 30 мин в буфере А (20 мМ трис ацетат, pH 7,5, 100 мМ KAc, 2,5 мМ MgCl ₂ , 2 мМ DTT) с добавлением 400 ед. Ингибитора РНКазы, 1 мМ АТФ, 0,25. мМ спермидин, 0,2 мМ GTP, 75 мкг общей тРНК (ацилированной всеми или отдельными аминокислотами и [ ³⁵ S] Met), 75 пмоль 40S и 60S очищенных рибосомных субъединиц, 125 пмоль eIF2, eIF3, eIF4A, ΔeIF4G, eIF4B, eIF1, eIF1A, eIF5, ΔeIF5B каждый, 200 пмоль eEF1H и 50 пмоль eEF2, а затем центрифугирование в роторе Beckman SW55 в течение 95 мин при 4 ° C, 50 000 об / мин в 10-30% (мас. / мас.) линейном градиенте плотности сахарозы. приготовлен в буфере А с 5 мМ MgCl ₂ .Фракции, соответствующие преТС-комплексам в соответствии с оптической плотностью и присутствием [ ³⁵ S] Met, были объединены, разбавлены в 3 раза буфером A, содержащим 1,25 мМ MgCl ₂ (до конечной концентрации 2,5 мМ Mg ²⁺ ) и используется в анализе высвобождения пептидов или анализе конформационной перегруппировки.

Для анализа высвобождения пептида аликвоты 30 мкл, содержащие 0,09 пмоль преТС, инкубировали при 37 ° C с 0,5 пмоль eRF1 и 10 пмоль DDX19B в течение 15 мин или с 0.1 пмоль eRF1, eRF3c с 0,2 мМ GTP и 10 пмоль DDX19B в течение 3 мин. Рибосомы и тРНК осаждали ледяной 5% TCA и центрифугировали при 14 000 g при 4 ° C. Количество высвобожденного [ ³⁵ S] -содержащего пептида определяли сцинтилляционным подсчетом супернатантов с использованием жидкостного сцинтилляционного спектрометра Intertechnique SL-30.

Для анализа конформационной перестройки (или отпечатка пальца) аликвоты 10 мкл, содержащие 0,03 пмоль преТС, инкубировали при 37 ° C в течение 15 мин с 0.625 пмоль мутантов eRF1 или eRF1 (eRF1 (AGQ), eRF1 (K83N), eRF1-OH), eRF3c / a с 0,2 мМ GTP / GMPPNP и 6,25 пмоль мутантов DDX19B или DDX19B. Образцы анализировали с использованием протокола удлинения праймеров. Анализ отпечатков пальцев ног проводили с использованием обратной транскриптазы AMV и меченного 5΄-FAM праймера 5΄-FAM-GCATTTGCAGAGGACAGG-3΄, комплементарного нуклеотидам 197-214 мРНК β-глобина. кДНК разделяли электрофорезом с использованием стандартных условий GeneScan ^® на ABI Prism ^® Genetic Analyzer 3100 (Applera).

Эффективность связывания стоп-кодонов рассчитывалась по формуле | $ \ frac {{TC}} {{TC + preTC}} \ times 100 \ (\%) $ | ⁠. Все данные были нормализованы по эффективности связывания стоп-кодона только для eRF1.

Анализ эффективности удлинения

Очищенные преТС использовали для определения эффективности элонгации в присутствии мутанта DDX19B или R372G. Для анализа комплексов eEF2-preTC аликвоты по 10 мкл, содержащие 0,03 пмоль преТС, инкубировали при 37 ° C в течение 15 мин с 1 пмоль eEF2 и 5 пмоль DDX19B или мутантом в присутствии 0.2 мМ GTP / GMPPNP. Образцы анализировали с использованием протокола удлинения праймеров. Эффективность сдвига −1 рассчитывалась по формуле | $ \ frac {{preTC — 1}} {{({preTC — 1}) + preTC}} \ times 100 \ (\%) $ | ⁠. Все данные были нормализованы на эффективность образования комплекса eEF2-GMMPNP.

Для анализа комплексов транслокации аликвоты по 10 мкл, содержащие 0,03 пмоль преТС, инкубировали при 37 ° C в течение 15 мин с различными количествами eEF1 (0,5, 1, 1,5, 4 пмоль), 8 пмоль suptRNA ^Ser , 4 пмоль eEF2 и 10 пмоль DDX19B или с различным количеством eEF2 (0.1, 1, 4 пмоль) 8 пмоль suptRNA ^Ser , 4 пмоль eEF1 и 10 пмоль DDX19B. Образцы анализировали с использованием протокола удлинения праймеров. Эффективность сдвига +3 рассчитывалась по формуле | $ \ frac {{preTC + 3}} {{({preTC + 3}) + preTC}} \ times 100 \ (\%) $ | ⁠.

Анализ связывания PreTC

Образцы 150 мкл очищенных преТС (1,35 пмоль) инкубировали либо с 10 пмоль DDX19B, либо с 10 пмоль eRF1, 10 пмоль eRF3c и 10 пмоль DDX19B в буфере A (20 мМ трис-HCl, pH 7.5, 2,5 мМ MgCl ₂ , 150 мМ KAc, 2 мМ DTT и 0,2 мМ GTP с 0,2 мМ MgCl ₂ ) при 37 ° C в течение 15 мин в присутствии различных нуклеотидов. Комплексы центрифугировали в линейном градиенте плотности сахарозы 10–30% (мас. / Мас.), Приготовленном с буфером A, содержащим 5 мМ MgCl ₂ , в течение 95 мин при 4 ° C и 50 000 об / мин с использованием ротора Beckman SW55. Каждый градиент фракционировали на 14 равных фракций с последующим осаждением с использованием 10% TCA. Осадки протеина сушили и анализировали вестерн-блоттингом.

Анализ АТФазы

АТФазы проводили в присутствии 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 15 мМ NH ₄ Cl, 5 мМ MgCl ₂ , 1% глицерина, 1 мМ DTT, 0,1 мг / мл поли (A ), 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина, 1 мМ АТФ и 0,1 мкл [α- ³² P] АТФ (20 мкКи / мкл, 3000 Ки / ммоль). Реакцию (10 мкл) инициировали добавлением 5 мкг очищенного DDX19 дикого типа или мутантов. После 30 мин инкубации при 37 ° C реакцию останавливали добавлением 500 мкл раствора, содержащего 5% древесный уголь в 25 мМ NaH ₂ PO ₄ для связывания свободного АТФ.Затем уголь осаждали центрифугированием, 375 мкл реакционной смеси подвергали жидкостному сцинтилляционному счету для количественного определения высвобожденного [ ³² P] фосфата.

РЕЗУЛЬТАТЫ

DDX19 человека ассоциирован с полисомами

Чтобы исследовать, сохраняется ли цитоплазматическая функция Dbp5 у высших эукариот, мы проверили ассоциацию DDX19 с полисомами в лизате клеток HEK293T. Вестерн-блот-анализ фракций после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы показал, что значительное количество DDX19 человека обнаруживается во фракциях, содержащих полисомы (рис. 1).Точно так же eRF1 обнаруживается в этих фракциях полисом. Основываясь на этом открытии, мы клонировали две аннотированные изоформы DDX19 человека (DDX19A и DDX19B), экспрессировали их в Escherichia coli , очистили белки и охарактеризовали их АТФазную активность (дополнительные данные). Мы наблюдали, что ферментативная активность двух изоформ была почти идентична. Затем мы проанализировали оба белка с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител, направленных против DDX19B. Мы обнаружили, что DDX19A также может быть обнаружен этими антителами (данные не показаны).Следовательно, мы не можем отличить на основе вестерн-блоттинга, какая из двух изоформ обнаруживается во фракции полисом. Поскольку во всех опубликованных исследованиях использовался DDX19B, и мы не наблюдали разницы между формами A и B в анализе АТФазы, мы решили сосредоточить все дальнейшие эксперименты на DDX19B. Однако в большинстве анализов мы также тестировали активность DDX19A.

Рисунок 1.

DDX19 ассоциируется с полисомами во время трансляции. Супернатант лизата клеток НЕК 293 загружали в градиент 10-60% сахарозы, центрифугировали, фракционировали и подвергали Вестерн-блот-анализу.Антитела против рибосомных белков L9 и S15 использовали для обнаружения субъединиц рибосом. Поглощение при 260 нм (OD, оптическая плотность) показывает распределение рибосом. DDX19 и eRF1 обнаруживаются специфическими антителами.

Рисунок 1.

DDX19 ассоциируется с полисомами во время трансляции. Супернатант лизата клеток НЕК 293 загружали в градиент 10-60% сахарозы, центрифугировали, фракционировали и подвергали Вестерн-блот-анализу. Антитела против рибосомных белков L9 и S15 использовали для обнаружения субъединиц рибосом.Поглощение при 260 нм (OD, оптическая плотность) показывает распределение рибосом. DDX19 и eRF1 обнаруживаются специфическими антителами.

Поскольку DDX19 был обнаружен во фракциях полисом, мы решили изучить, влияет ли и как DDX19 на трансляцию эукариот in vitro . DDX19B добавляли ко всем трансляционным комплексам (инициация, элонгация и терминация), которые были собраны in vitro из отдельных компонентов на мРНК MVHL-UAA. Для проверки трансляции комплексных образований был проведен анализ отпечатков пальцев.Неожиданно мы не наблюдали разницы в эффективности сборки рибосомных комплексов в присутствии или в отсутствие DDX19B (дополнительные данные).

Ранее было показано, что дрожжевой аналог Dbp5 связывает eRF1 РНК-независимым образом (20). Поэтому мы проверили, взаимодействует ли DDX19 напрямую с человеческим eRF1. После предварительной инкубации DDX19B с eRF1 реакцию наносили на колонку для гель-фильтрации. Мы не смогли обнаружить комплексообразование в отсутствие рибосом, что указывает на отсутствие прямого взаимодействия или взаимодействия с низким сродством eRF1 и DDX19 (дополнительные данные).

DDX19 связывает преТС нуклеотид-зависимым образом

Поскольку DDX19 был обнаружен в полисомальных фракциях лизатов клеток HEK293T, мы затем спросили, может ли этот белок связываться с очищенными preTC и TC в присутствии или в отсутствие ATP, ADP или негидролизуемого аналога ATP (AMPPNP). Рибосомные комплексы, очищенные центрифугированием SDG, инкубировали с DDX19B, факторами высвобождения и нуклеотидами. Комплексы снова центрифугировали в SDG. DDX19B определяли во фракциях с помощью вестерн-блоттинга.

Чтобы исключить, что результирующий профиль вызван агрегацией DDX19B, мы проверили распределение этого белка в SDG в отсутствие рибосомных комплексов. Один только DDX19B может быть обнаружен только в верхних фракциях градиента (фракции 1–4), тогда как рибосомные комплексы мигрируют во фракциях 8–14 (рис. 2А).

Рисунок 2.

эксперимента по связыванию preTC с DDX19 и факторами высвобождения. ( A ) Вестерн-блоттинг DDX19B и очищенных преТС, разделенных центрифугированием SDG с использованием антител, индуцированных против DDX19B и рибосомного белка L9, соответственно.( B ) Вестерн-блоттинг очищенных preTC или TC с комплексом факторов высвобождения eRF1-eRF3a-GTP, связанным с DDX19B в присутствии ATP, ADP и AMPPNP и разделенным посредством центрифугирования SDG. Для обнаружения использовали антитела против DDX19B. ( C ) Вестерн-блоттинг очищенных преТС, связанных с DDX19B E243Q в присутствии АТФ и разделенных центрифугированием SDG. Для обнаружения использовали антитела против DDX19B.

Рисунок 2.

эксперимента по связыванию preTC с DDX19 и факторами высвобождения.( A ) Вестерн-блоттинг DDX19B и очищенных преТС, разделенных центрифугированием SDG с использованием антител, индуцированных против DDX19B и рибосомного белка L9, соответственно. ( B ) Вестерн-блоттинг очищенных preTC или TC с комплексом факторов высвобождения eRF1-eRF3a-GTP, связанным с DDX19B в присутствии ATP, ADP и AMPPNP и разделенным посредством центрифугирования SDG. Для обнаружения использовали антитела против DDX19B. ( C ) Вестерн-блоттинг очищенных преТС, связанных с DDX19B E243Q в присутствии АТФ и разделенных центрифугированием SDG.Для обнаружения использовали антитела против DDX19B.

В отсутствие нуклеотидов, а также в присутствии АТФ и АДФ DDX19B не образовывал стабильных комплексов с преТС и ТС. Добавление AMPPNP к реакционной смеси увеличивало образование комплексов и / или стабилизировало связывание DDX19B с рибосомными комплексами (рис. 2В). Примечательно, что факторы высвобождения eRF1 и eRF3a (полноразмерный eRF3, изоформа а) практически не влияли на образование комплексов DDX19B-рибосома.

Мы предположили, что присутствие негидролизуемого аналога АТФ (AMPPNP) предотвращает диссоциацию DDX19B из рибосомных комплексов.Чтобы проверить эту гипотезу, мы создали мутант DDX19B (E243Q), дефектный в гидролизе АТФ (7). Как и ожидалось, отсутствие активности АТФазы стабилизировало комплексы DDX19B (E243Q) -preTC в присутствии АТФ во время центрифугирования SDG (рис. 2С).

DDX19 стимулирует эффективность образования ТК

Поскольку DDX19B связывает очищенные preTC и TC в присутствии AMPPNP, мы решили изучить влияние этого белка на терминацию трансляции с использованием очищенных комплексов.Мы собрали preTCs in vitro из отдельных компонентов на мРНК MVHL-UAA и затем очистили центрифугированием SDG. Затем мы использовали их для проверки образования ТЦ в присутствии DDX19B. Для этого был проведен анализ образовавшихся комплексов по отпечатку пальца (рис. 3). Суть метода заключается в обнаружении положений стабильных рибосомных комплексов на мРНК посредством синтеза продуктов кДНК с помощью обратной транскриптазы (рис. 3А). Молекулы кДНК синтезируются с флуоресцентно меченными праймерами.На рисунке 3B мы показываем примеры необработанных данных анализа отпечатков пальцев, полученных с помощью капиллярного электрофореза кДНК.

Рисунок 3.

DDX19B увеличивает образование ТЦ. ( A ) Схема анализа отпечатков пальцев при образовании комплекса рибосома-мРНК. Стабильный рибосомный комплекс на мРНК останавливает обратную транскриптазу (AMV) в определенном положении, генерируя продукты кДНК определенной длины. Молекулы кДНК, синтезированные с флуоресцентно меченными праймерами, разделяются и обнаруживаются с помощью фрагментного анализа.( B ) Примеры исходных данных капиллярного электрофореза продуктов кДНК, полученных с использованием флуоресцентно меченных праймеров для анализа отпечатков пальцев. PreTC показаны после очистки SDG, образование TC индуцируется добавлением eRF1 и eRF3c к preTC. Позиции preTC и TC помечены белыми и черными треугольниками соответственно. ( C ) Анализ отпечатка пальца терминальных комплексов, образованных добавлением к преТС eRF1, eRF1 + eRF3c + GTP, eRF1 + eRF3a + GTP и DDX19B + ATP.Rfu — единица относительной флуоресценции. Позиции preTC и TC помечены белыми и черными треугольниками соответственно. ( D ) Относительный количественный анализ эффективности связывания стоп-кодона eRF в присутствии DDX19B. Эффективность связывания стоп-кодона только для eRF1 была принята за 100%. Столбики ошибок представляют собой стандартное отклонение, звездочки (**) обозначают значимое отличие от соответствующего контроля P <0,01 (n = 3).

Рисунок 3.

DDX19B увеличивает образование ТХ.( A ) Схема анализа отпечатков пальцев при образовании комплекса рибосома-мРНК. Стабильный рибосомный комплекс на мРНК останавливает обратную транскриптазу (AMV) в определенном положении, генерируя продукты кДНК определенной длины. Молекулы кДНК, синтезированные с флуоресцентно меченными праймерами, разделяются и обнаруживаются с помощью фрагментного анализа. ( B ) Примеры исходных данных капиллярного электрофореза продуктов кДНК, полученных с использованием флуоресцентно меченных праймеров для анализа отпечатков пальцев. PreTC показаны после очистки SDG, образование TC индуцируется добавлением eRF1 и eRF3c к preTC.Позиции preTC и TC помечены белыми и черными треугольниками соответственно. ( C ) Анализ отпечатка пальца терминальных комплексов, образованных добавлением к преТС eRF1, eRF1 + eRF3c + GTP, eRF1 + eRF3a + GTP и DDX19B + ATP. Rfu — единица относительной флуоресценции. Позиции preTC и TC помечены белыми и черными треугольниками соответственно. ( D ) Относительный количественный анализ эффективности связывания стоп-кодона eRF в присутствии DDX19B. Эффективность связывания стоп-кодона только для eRF1 была принята за 100%.Столбики ошибок представляют собой стандартное отклонение, звездочки (**) обозначают значимое отличие от соответствующего контроля P <0,01 (n = 3).

Во время распознавания стоп-кодона eRF1 рибосома защищает дополнительные нуклеотиды на мРНК, которые могут быть обнаружены в анализах отпечатков пальцев ног как сдвиг на два нуклеотида рибосомного комплекса (рис. 3C) (22,39,40). В преТС стоп-кодон находится в А-сайте рибосомы. Добавление eRF1 приводит к появлению пика, смещенного на два нуклеотида вперед, что соответствует образованию TC во время распознавания стоп-кодона eRF1.В наших экспериментах мы использовали предельные концентрации факторов высвобождения для моделирования физиологических условий. Это позволило нам обнаружить любое изменение активности фактора высвобождения в присутствии DDX19.

Анализ отпечатков пальцев показал, что добавление DDX19B к preTC с eRF1 увеличивает количество образующихся TC (рис. 3C и D). Используя различные количества DDX19B, мы подтвердили специфичность стимулирующего эффекта DDX19B на образование TC (дополнительные данные). Интересно, что DDX19A показал ту же активность, что и DDX19B (дополнительные данные).

В присутствии обоих факторов высвобождения (eRF1 и eRF3) и GTP DDX19B также стимулировал сдвиг на два нуклеотида (рис. 3C). Количественный анализ показал, что стимулирующий эффект DDX19B более выражен в присутствии только eRF1 (в 3 раза) по сравнению с eRF1 + eRF3a / c и GTP (примерно в 2 раза) (рис. 3D). Вероятно, это связано с более высокой эффективностью образования ТЦ. Более того, DDX19B стимулировал образование TC в аналогичной степени в присутствии различных вариантов eRF3, полноразмерного eRF3a и усеченной на N-конце версии eRF3c, лишенной первых 138 аминокислот (фигура 3D).Это указывает на то, что стимулирующий эффект DDX19B не зависит от N-концевого домена eRF3a. В отсутствие факторов высвобождения влияние DDX19B на preTCs не наблюдалось в анализах отпечатков пальцев (рис. 3C).

DDX19 увеличивает гидролиз пептидил-тРНК факторами высвобождения

отпечатков пальцев продемонстрировал, что DDX19 стимулирует образование ОК. Таким образом, чтобы исследовать, влияет ли DDX19 на гидролиз пептидил-тРНК, мы собрали preTCs на мРНК MVHL-UAA с использованием S ³⁵ -меченой инициаторной тРНК.Эффективность гидролиза пептидил-тРНК определяли количественным определением радиоактивного пептида MVHL, высвобожденного из рибосомных комплексов, которые инкубировали с насыщающими количествами eRF1, eRF3c-GTP и DDX19B в присутствии АТФ или AMPPNP. Мы обнаружили, что эффективность высвобождения пептида увеличивается после добавления DDX19B к реакции терминации (рис. 4). Инкубация DDX19B с preTC и eRF1 увеличивает эффективность гидролиза пептидил-тРНК примерно в 5 раз (рис. 4A). Напротив, добавление DDX19B к реакции терминации, вызванной eRF1 + eRF3c + GTP, стимулирует гидролиз пептидил-тРНК примерно в 2 раза (рис. 4B).

Рисунок 4.

DDX19B увеличивает эффективность гидролиза пептидил-тРНК, вызванного факторами высвобождения. ( A ) Гидролиз пептидил-тРНК, индуцированный добавлением eRF1 в присутствии / отсутствии DDX19B с АТФ или AMPPNP (n = 3). ( B ) Гидролиз пептидил-тРНК, индуцированный добавлением eRF1 и eRF3c в присутствии / отсутствии DDX19B с АТФ или AMPPNP (n = 3). Столбики ошибок представляют собой стандартное отклонение, звездочки (**) обозначают значимое отличие от соответствующего контроля P <0.01.

Рисунок 4.

DDX19B увеличивает эффективность гидролиза пептидил-тРНК, вызванного факторами высвобождения. ( A ) Гидролиз пептидил-тРНК, индуцированный добавлением eRF1 в присутствии / отсутствии DDX19B с АТФ или AMPPNP (n = 3). ( B ) Гидролиз пептидил-тРНК, индуцированный добавлением eRF1 и eRF3c в присутствии / отсутствии DDX19B с АТФ или AMPPNP (n = 3). Столбики ошибок представляют собой стандартное отклонение, звездочки (**) обозначают значимое отличие от соответствующего контроля P <0.01.

Мы проверили необходимость диссоциации DDX19 от рибосомных комплексов для активации высвобождения пептида. В экспериментах по связыванию preTC мы показали, что AMPPNP предотвращает диссоциацию DDX19B из рибосомных комплексов (рис. 2B). Поэтому мы сравнили активность DDX19B в присутствии АТФ и AMPPNP в анализе высвобождения пептидов (рис. 4). DDX19B увеличивает гидролиз пептидил-тРНК одинаково в присутствии АТФ или AMPPNP как с eRF1, так и с eRF1 + eRF3c + GTP. Таким образом, стимуляция высвобождения пептида с помощью DDX19 происходит до его диссоциации от рибосомы.

Активация терминации трансляции происходит во время распознавания стоп-кодона

Чтобы определить стадию, на которой происходит активация терминации трансляции с помощью DDX19B, до или во время гидролиза пептидил-тРНК, мы использовали мутант eRF1 (AGQ), который не может индуцировать высвобождение пептида (27) в анализе отпечатков пальцев. Мы обнаружили, что DDX19B активирует распознавание стоп-кодона eRF1 (AGQ) в той же степени, что и для wt eRF1 (рис. 5A, дополнительные данные).

Рисунок 5.

Активность DDX19B в терминации трансляции в присутствии вариантов eRF. Относительный количественный анализ эффективности связывания стоп-кодонов ( A ) eRF1 (AGQ), eRF1 (AGQ) + eRF3c + GTP, eRF1 + eRF3c + GMPPNP и ( B ) eRF1 (K83N), гидроксилированный eRF1- (eRF1- (eRF1- OH) в присутствии DDX19B. Эффективность связывания стоп-кодона только для eRF1 была принята за 100% (n = 3). ( C ) АТФазная активность мутантов DDX19B E243Q, R372G и R429Q (n = 3). ( D ) Относительный количественный анализ эффективности связывания стоп-кодона мутантов eRF1, eRF1 + eRF3c + GTP и DDX19B в присутствии АТФ или AMPPNP.Эффективность связывания стоп-кодона только для eRF1 была принята за 100% (n = 3). Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение.

Рисунок 5.

Активность DDX19B в терминации трансляции в присутствии вариантов eRFs. Относительный количественный анализ эффективности связывания стоп-кодонов ( A ) eRF1 (AGQ), eRF1 (AGQ) + eRF3c + GTP, eRF1 + eRF3c + GMPPNP и ( B ) eRF1 (K83N), гидроксилированный eRF1- (eRF1- (eRF1- OH) в присутствии DDX19B. Эффективность связывания стоп-кодона только для eRF1 была принята за 100% (n = 3).( C ) АТФазная активность мутантов DDX19B E243Q, R372G и R429Q (n = 3). ( D ) Относительный количественный анализ эффективности связывания стоп-кодона мутантов eRF1, eRF1 + eRF3c + GTP и DDX19B в присутствии АТФ или AMPPNP. Эффективность связывания стоп-кодона только для eRF1 была принята за 100% (n = 3). Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение.

Чтобы проверить, связана ли активация терминации DDX19B с гидролизом GTP с помощью eRF3, мы добавили негидролизуемый аналог GTP (GMPPNP) в анализы отпечатков пальцев.Мы наблюдали, что в присутствии GMPPNP DDX19B также активирует образование TC (рис. 5A, дополнительные данные). Следовательно, стимуляция терминации трансляции происходит до гидролиза GTP с помощью eRF3. Следовательно, он предшествует аккомодации M домена eRF1 в PTC рибосомы и гидролизу пептидил-тРНК.

Dbp5, дрожжевой аналог DDX19, снижает прохождение стоп-кодонов в штаммах с мутантным eRF1 (SUP45-2 K80N) (20). Поэтому мы решили проверить, как DDX19B влияет на активность мутанта eRF1 человека с такой же заменой (K83N).Подобно wt eRF1, распознавание стоп-кодона eRF1 (K83N) стимулируется добавлением DDX19B (рисунок 5B, дополнительные данные).

Ранее мы показали, что C4-лизилгидроксилирование остатка eRF1 K63 необходимо для оптимальной эффективности терминации трансляции (35). Недавно опубликованные криоЭМ-структуры терминирующих комплексов эукариот подтвердили, что модифицированный лизин 63 принимает непосредственное участие в распознавании первого нуклеотида стоп-кодона (39,40). Было протестировано влияние DDX19B на гидроксилированную форму eRF1 (eRF1-OH).Мы обнаружили, что активация eRF1 с помощью DDX19B не зависит от гидроксилирования eRF1 (рис. 5B, дополнительные данные).

Мутанты DDX19 активируют прекращение трансляции

Чтобы подтвердить, что активность DDX19B в терминации не зависит от гидролиза АТФ, мы протестировали мутант DDX19 человека с дефектом по активности АТФазы (DDX19 (E243Q)) с помощью анализа отпечатков пальцев ног (7). Очищенный рекомбинантный белок был охарактеризован с использованием анализов АТФазы (рис. 5C).Как и ожидалось, активность АТФазы DDX19 (E243Q) была значительно снижена. Этот мутант стимулировал образование ОК в той же степени, что и DDX19B дикого типа (фиг. 5D, дополнительные данные). Это подтверждает, что активация терминации трансляции происходит до гидролиза АТФ. Кроме того, мы выполнили анализ отпечатка пальца стопы комплексов в присутствии AMPPNP (рисунок 5D, дополнительные данные). Как и ожидалось, DDX19B стимулировал образование TC также в присутствии AMPPNP.

DDX19B также связывает РНК (7), поэтому мы спросили, меняет ли эта способность ее стимулирующий эффект на терминацию трансляции.Мы получили две мутантные формы DDX19B, дефицитные по связыванию РНК (DDX19 (R372G) и DDX19 (R429Q)) (7,41). Как было показано ранее, эти мутанты были практически неактивны в анализах АТФазы (рис. 5C) (7). В анализах отпечатков пальцев DDX19 (R372G) и DDX19 (R429Q) активировали образования TC в той же степени, что и DDX19 дикого типа (рис. 5D, дополнительные данные). Следовательно, РНК-связывающая активность DDX19B не требуется для его функции в терминации трансляции.

DDX19 стимулирует активность факторов удлинения трансляции в рибосоме

Мы показали, что DDX19B эффективно связывает преТС (рис. 2В).Однако, помимо eRF, факторы элонгации трансляции eEF1 и eEF2 могут взаимодействовать с preTC (22). eEF2 способен связываться с вакантным preTC в присутствии GTP / GMPPNP, что вызывает сдвиг на -1 нуклеотид в анализе отпечатка пальца (фиг. 6A). Это можно объяснить конформационным изменением, вызванным взаимодействием eEF2-GMPPNP с рибосомой (42). Примечательно, что в присутствии GTP никаких конформационных изменений в рибосоме, индуцированных eEF2, не обнаруживается (22). Добавление DDX19B значительно увеличивает сдвиг -1 рибосомного комплекса в присутствии eEF2 и GMPPNP (фиг. 6A).Мы пришли к выводу, что DDX19B стабилизирует рибосомный комплекс, взаимодействующий с eEF2-GMPPNP. Наши данные были подтверждены количественным анализом эффективности сдвига -1 (фиг. 6B), что указывает на 3-кратную стимуляцию образования комплекса eEF2-GMPPNP с помощью DDX19B.

Рисунок 6.

DDX19B стабилизирует комплексы удлинения трансляции. ( A ) Анализ отпечатков пальцев ног комплексов eEF2-preTC с GTP или GMPPNP в присутствии DDX19B. ( C ) Анализ отпечатков пальцев рибосомных комплексов, полученных в результате декодирования стоп-кодона с помощью eEF1-suptRNA ^Ser -GTP после транслокации рибосом, индуцированной eEF2-GTP в присутствии DDX19B.Rfu — единица относительной флуоресценции. Позиции preTC помечены белыми треугольниками, preTC-1 — серым, preTC + 3 — черным. ( B ) Относительный количественный анализ эффективности смены — 1 eEF2-GMPPNP в присутствии DDX19B. Эффективность сдвига -1 для eEF2-GMPPNP была принята за 100%. Столбики ошибок представляют собой стандартное отклонение, звездочки (**) обозначают значимое отличие от соответствующего контроля P <0,01 (n = 3). ( D ) Количественный анализ эффективности транслокации в присутствии DDX19B.

Рисунок 6.

DDX19B стабилизирует комплексы удлинения трансляции. ( A ) Анализ отпечатков пальцев ног комплексов eEF2-preTC с GTP или GMPPNP в присутствии DDX19B. ( C ) Анализ отпечатков пальцев рибосомных комплексов, полученных в результате декодирования стоп-кодона с помощью eEF1-suptRNA ^Ser -GTP после транслокации рибосом, индуцированной eEF2-GTP в присутствии DDX19B. Rfu — единица относительной флуоресценции. Позиции preTC помечены белыми треугольниками, preTC-1 — серым, preTC + 3 — черным.( B ) Относительный количественный анализ эффективности смены — 1 eEF2-GMPPNP в присутствии DDX19B. Эффективность сдвига -1 для eEF2-GMPPNP была принята за 100%. Столбики ошибок представляют собой стандартное отклонение, звездочки (**) обозначают значимое отличие от соответствующего контроля P <0,01 (n = 3). ( D ) Количественный анализ эффективности транслокации в присутствии DDX19B.

Трехкомпонентный комплекс элонгации (eEF1-аминоацил-тРНК-GTP) наиболее близко соответствует тернарному комплексу терминации (eRF1-eRF3-GTP).Чтобы восстановить одну стадию удлинения трансляции в анализе отпечатка пальца, мы сконструировали тРНК-супрессор охры путем сайт-специфического мутагенеза антикодона тРНК человека ^Ser . Различные количества комплекса eEF1-Ser-тРНК ^Ocher -GTP и eEF2-GTP были добавлены к preTC, и полученные транслоцированные комплексы были проанализированы в анализе отпечатков пальцев (фиг. 6C и D). Обнаружен сдвиг рибосомных комплексов на +3, что соответствует перемещению рибосомы на один кодон вперед.Добавление DDX19B к реакции транслокации, как в случае ограниченного количества eEF1, так и в случае ограниченного количества eEF2, увеличивало эффективность сдвига +3 (рис. 6C и D). Следовательно, взаимодействие DDX19 с рибосомой стимулирует активность обоих факторов удлинения трансляции.

Чтобы изучить влияние РНК-связывающей активности DDX19 на элонгацию трансляции, мы добавили мутант DDX19 (R372G), неспособный связывать РНК, в анализы эффективности элонгации (дополнительные данные). Мы наблюдали, что мутант R372G, как DDX19 дикого типа, увеличивает связывание обоих факторов элонгации трансляции с рибосомой.Следовательно, РНК-связывающая активность DDX19 не является существенной для стимуляции удлинения.

ОБСУЖДЕНИЕ

Здесь мы показываем, что DDX19 человека связан с полисомами во время трансляции в лизатах клеток HEK293 (рис. 1A), как описано ранее для гомолога Dbp5 в дрожжах (20). Это указывает на то, что DDX19 участвует в биосинтезе белка или контроле трансляции. Однако эффективность сборки рибосомных комплексов in vitro не зависит от присутствия DDX19 (дополнительные данные).Вероятно, большой избыток факторов трансляции in vitro с небольшим количеством мРНК маскирует действие DDX19. Однако, когда preTCs очищены от всех компонентов трансляции, DDX19 стимулирует удлинение и прекращение трансляции (Рисунки 3, 4 и 6). Используя мутантный eRF1 (AGQ), мы показываем, что такая стимуляция происходит во время распознавания стоп-кодона (рис. 5А). Мы не обнаружили стабильных комплексов, образованных eRF1 и DDX19 в растворе (дополнительные данные). Это отличает DDX19 человека от дрожжевого Dbp5, который коиммунопреципитирует с eRF1 (20).Возможно, DDX19 человека утратил способность напрямую взаимодействовать с eRF1 в растворе и может образовывать комплексы только в присутствии рибосом. Обе формы DDX19 (A и B) обладают сходной активностью в тестах на АТФазу (дополнительные данные), экспериментах по связыванию рибосом и анализах отпечатков пальцев (дополнительные данные). Оба белка представлены в большинстве тканей. Вероятно, они выполняют ту же функцию при переводе.

В наших экспериментах N-концевой домен eRF3a не влияет на активность DDX19 в терминации трансляции (рис. 3C и D).Более того, мы демонстрируем, что активность DDX19 в терминации не зависит от eRF3 (рис. 3C и D). Этот результат согласуется с более ранними данными, полученными для Dbp5, который также не может связывать eRF3a в дрожжах (20). Роль DDX19 в терминации дополнительно подтверждается наблюдаемой повышенной эффективностью распознавания стоп-кодона с использованием мутантного eRF1 eRF1 (K83N) (рис. 5B). Аналогичным образом было показано, что дрожжевой Dbp5 снижает прохождение стоп-кодона в присутствии мутантного фактора высвобождения SUP45-2 (K80N) (20).В этом мутанте eRF1 мутированный аминокислотный остаток расположен в N-домене eRF1, а в терминальных комплексах лизин 83 расположен очень близко к тРНК в Р-сайте рибосомы (39,40). Лизин 83, вероятно, взаимодействует с тРНК в сайте P через свой положительный заряд и тем самым стабилизирует связывание eRF1 в сайте A рибосомы (центр декодирования). Мутация K83 очень вероятно нарушает правильное позиционирование eRF1 в сайте A рибосомы и в результате подавляет распознавание стоп-кодона eRF1.

Помимо активации распознавания стоп-кодона DDX19, мы обнаружили его стимулирующий эффект на гидролиз пептидил-тРНК (рис. 4A и B). Однако с помощью анализа конформационной перестройки TC, полученного с помощью eRF1 (AGQ), мы продемонстрировали, что усиление распознавания стоп-кодона с помощью DDX19 не требует гидролитической активности пептидил-тРНК eRF1 (рис. 5A). Вероятно, в анализе высвобождения пептида мы наблюдаем вторичный эффект активации DDX19 распознавания стоп-кодона eRF1.Очевидно, что определение точного механизма активации терминации трансляции с помощью DDX19 требует дальнейших исследований.

Стабильные комплексы между DDX19 и preTC или TC были обнаружены только в присутствии AMPPNP (рис. 2B). Мы предположили, что DDX19 диссоциирует от рибосомы после гидролиза АТФ. Эта гипотеза была подтверждена мутантом DDX19, дефектным по гидролизу АТФ, который эффективно связывает преТС даже в присутствии АТФ (рис. 2С). Мы пришли к выводу, что DDX19 взаимодействует с преТС в присутствии АТФ и диссоциирует от рибосомы после гидролиза АТФ.Известно, что AMPPNP и ADP в одинаковой степени стимулируют взаимодействие DDX19 с РНК (7). Мы продемонстрировали, что DDX19 не образует стабильных комплексов с preTC или TC в присутствии ADP. Это указывает на то, что наблюдаемая ассоциация DDX19 с рибосомой специфична и не зависит от его РНК-связывающей активности. Кроме того, мы показали, что активация распознавания стоп-кодона и высвобождение пептида с помощью DDX19 не зависит от гидролиза АТФ или способности DDX19 связывать РНК (фигуры 4 и 5D).В присутствии AMPPNP DDX19 увеличивает распознавание стоп-кодонов и гидролиз пептидил-тРНК с помощью eRF1. Следовательно, DDX19 активирует терминацию трансляции в своей АТФ-связанной форме.

Было показано, что сверхэкспрессия факторов трансляции не влияет на скорость синтеза белка и рост клеток (32). Единственным исключением является eRF1, где 2-кратное увеличение концентрации приводит к усиленному синтезу белка и росту клеток. Снижение концентрации клеточного eRF1 резко снижает скорость трансляции.Возможно, клеточная концентрация eRF1 строго контролируется и ограничивается, чтобы обеспечить оптимальный баланс между нормальным прекращением трансляции, повторной инициацией и нонсенс-опосредованным распадом мРНК. В наших экспериментах мы использовали 0,03 пмоль preTC (т.е. активные рибосомы) и 0,625 пмоль eRF каждый. В нашей системе эффективность распознавания стоп-кодонов очень низкая, и даже в присутствии 20-кратного избытка eRFs по сравнению с рибосомами DDX19 увеличивает активность терминации. У дрожжей количество копий eRF1 оценивается в 22 000 молекул на клетку, и было определено около 200 000 рибосом на клетку (32).Таким образом, в клетке соотношение eRF1 / рибосома составляет около 0,1. Это означает, что в цитоплазме должны присутствовать дополнительные поддерживающие факторы терминации трансляции для поддержания соответствующего уровня высвобождения пептида в этих условиях. Ранее мы продемонстрировали, что деацилированная тРНК, связанная в E-сайте рибосомы, является одним из активирующих факторов терминации (38). Здесь мы показываем, что DDX19 является вторым стимулирующим фактором завершения трансляции. Следовательно, одна из физиологических ролей DDX19 в живых клетках заключается в стабилизации комплексов терминации рибосом.

Мы показали, что DDX19 связывается с preTC, которые состоят из рибосомы и пептидил-тРНК, независимо от факторов высвобождения (рис. 2B). Поэтому мы предполагаем, что связывание DDX19 предшествует прекращению трансляции и может также влиять на стадию элонгации. Действительно, мы демонстрируем стабилизацию комплексов eEF1-aatRNA-GTP- и eEF2-GTP / GMPPNP-рибосома с помощью DDX19 (рис. 6). DDX19 стабилизирует оптимальную конформацию рибосомы для распознавания стоп-кодона с помощью eRF1, который связывается с сайтом A рибосомы.Следовательно, неудивительно, что DDX19 может также стабилизировать оптимальный рибосомный комплекс для связывания аминоацил-тРНК-eEF1 или eEF2 с тем же самым сайтом A. Очевидно, что активация элонгации трансляции не должна влиять на прекращение трансляции, поскольку они являются независимыми и неконкурентными стадиями биосинтеза белка. Мы предполагаем, что реальным субстратом DDX19 является рибосома 80S в разных состояниях. Вероятно, связывание DDX19 с рибосомой замедляет переключение между различными конформациями рибосом, стабилизируя как терминацию, так и различные состояния элонгации.Мы пришли к выводу, что DDX19 стабилизирует 80S рибосомные комплексы с различными белками, связанными с сайтом A.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарны Людмиле Фроловой за предоставление плазмид, кодирующих факторы высвобождения, Мэтью Колману за предоставление препарата гидроксилированной формы человеческого eRF1, а также Татьяне Пестовой и Кристоферу Хеллену, предоставившим нам плазмиды, кодирующие факторы инициации.Секвенирование плазмид, кодирующие мутантные белки и анализ фрагментов кДНК были выполнены центром коллективного пользования «Геном» EIMB РАН. Авторы хотели бы поблагодарить Кристиан Шаффицель за подготовку eRF3a и критическое прочтение рукописи.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Российский научный фонд [14-14-00487]. Источник финансирования открытого доступа: Российский научный фонд [14-14-00487].

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

Линдер

P.

Янковский

E.

От раскручивания до зажима — семейство DEAD-бокс-РНК-геликазы

Nat. Rev. Mol. Cell Biol.

2011

12

505

516

Линдер

с.

Fuller-Pace

F.V.

Оглядываясь назад на рождение геликаз DEAD-box РНК

Биохим. Биофиз. Acta

2013

1829

750

755

Фэрман-Уильямс

М.Э.

Guenther

U.P.

Янковский

E.

Геликасы SF1 и SF2: семейные дела

Curr. Opin. Struct. Биол.

2010

20

313

324

Янковский

E.

РНК-геликазы в действии: связывание и перестройка

Trends Biochem. Sci.

2011

36

19

29

Кордин

О.

Banroques

J.

Tanner

N.K.

Linder

P.

Семейство белков DEAD-бокса РНК-геликаз

Ген

2006

367

17

37

Чжао

Дж.

Jin

S.B.

Бьоркрот

Б.

Wieslander

L.

Daneholt

B.

Фактор экспорта мРНК Dbp5 связан с мРНП кольца Бальбиани от гена к цитоплазме

EMBO J.

2002

21

1177

1187

Шмитт

В.

фон Коббе

К.

Бачи

А.

Pante

N.

Rodrigues

JP

Boscheron

C.

Rigaut

G.

Wilm

M.

M.

Dbp5, белок DEAD-бокса, необходимый для экспорта мРНК, рекрутируется в цитоплазматические фибриллы комплекса ядерных пор посредством консервативного взаимодействия с CAN / Nup159p

EMBO J.

1999

18

4332

4347

Коллинз

р.

Karlberg

T.

Lehtio

L.

Schutz

P.

van den Berg

S.

Dahlgren

L.G.

Hammarstrom

M.

Weigelt

J.

Schuler

H.

DEXD / H-бокс РНК-геликаза DDX19 регулируется альфа-спиральным переключателем

J. Biol. Chem.

2009

284

10296

10300

Ценг

С.С.

Weaver

P.L.

Liu

Y.

Hitomi

M.

Tartakoff

A.M.

Чанг

T.H.

Dbp5p, цитозольная РНК-геликаза, необходима для экспорта поли (A) + РНК

EMBO J.

1998

17

2651

2662

Снай-Ходж

C.A.

Colot

H.V.

Goldstein

A.L.

Cole

C.N.

Dbp5p / Rat8p представляет собой белок DEAD-бокса, связанный с ядерными порами дрожжей, необходимый для экспорта РНК

EMBO J.

1998

17

2663

2676

фон Мёллер

H.

Basquin

C.

Conti

E.

Белок экспорта мРНК DBP5 связывает РНК и цитоплазматический нуклеопорин NUP214 взаимоисключающим образом

Nat. Struct. Мол. Биол.

2009

16

247

254

Napetschnig

Дж.

Kassube

S.A.

Debler

E.W.

Wong

R.W.

Blobel

G.

Hoelz

A.

Структурный и функциональный анализ взаимодействия нуклеопорина Nup214 с DEAD-бокс-геликазой Ddx19

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2009

106

3089

3094

Ходжа

с.А.

Colot

H.V.

Stafford

P.

Cole

C.N.

Rat8p / Dbp5p представляет собой фактор челночного транспорта, который взаимодействует с Rat7p / Nup159p и Gle1p и подавляет дефект экспорта мРНК клеток xpo1-1

EMBO J.

1999

18

5778

5788

Вейрих

с.С.

Erzberger

J.P.

Flick

J.S.

Berger

J.M.

Thorner

J.

Weis

K.

Активация DExD / H-бокса белка Dbp5 белком ядерных пор Gle1 и его коактиватором InsP6 необходима для экспорта мРНК

Nat. Cell Biol.

2006

8

668

676

Алькасар-римский

А.Р.

Tran

E.J.

Guo

S.

Wente

S.R.

Гексакисфосфат инозита и Gle1 активируют DEAD-бокс-белок Dbp5 для экспорта ядерной мРНК

Nat. Cell Biol.

2006

8

711

716

Тран

E.J.

Чжоу

Ю.

Corbett

A.H.

Wente

S.R.

DEAD-бокс-белок Dbp5 контролирует экспорт мРНК, запуская определенные события ремоделирования РНК: белка

Мол. Ячейка

2007

28

850

859

Лунд

М.К.

Guthrie

C.

DEAD-бокс-белок Dbp5p необходим для диссоциации Mex67p от экспортированных мРНП на ядерном крае

Мол. Ячейка

2005

20

645

651

Золотухина

A.S.

Uranishi

H.

Lindtner

S.

Bear

J.

Pavlakis

G.N.

Felber

B.K.

Фактор ядерного экспорта RBM15 облегчает доступ DBP5 к мРНК

Nucleic Acids Res.

2009

37

7151

7162

Rajakyla

E.K.

Viita

T.

Kyheroinen

S.

Huet

G.

Treisman

R.

Vartiainen

M.K.

РНК Ddx19 необходим для ядерного импорта коактиватора SRF MKL1

Nat. Commun.

2015

6

5978

Брутто

т.

Siepmann

A.

Sturm

D.

Windgassen

M.

Scarcelli

J.J.

Зеедорф

М.

Коул

C.N.

Креббер

H.

DEAD-бокс РНК-геликаза Dbp5 действует в терминации трансляции

Наука

2007

315

646

649

Сейт-Неби

А.

Фролова

Л.

Киселев

Л.

Преобразование всемогущего фактора терминации трансляции eRF1 в унипотентный eRF1, подобный инфузории, только UGA

EMBO Rep.

2002

3

881

886

Алкалаева

E.Z.

Писарев

А.В.

Фролова

Л.Ю.

Киселев

Л.Л.

Пестова

Т.В.

Восстановление эукариотической трансляции in vitro выявляет кооперативность между факторами высвобождения eRF1 и eRF3

Ячейка

2006

125

1125

1136

Сайто

к.

Ито

К.

Генетический анализ L123 тРНК-имитирующего фактора высвобождения эукариот eRF1, аминокислотного остатка, важного для распознавания стоп-кодонов

Nucleic Acids Res.

2015

43

4591

4601

Бланше

с.

Rowe

M.

Von der Haar

T.

Fabret

C.

Demais

S.

Howard

M.J.

Namy

Новый взгляд на распознавание стоп-кодонов с помощью eRF1

Nucleic Acids Res.

2015

43

3298

3308

Wada

М.

Ито

К.

Генетический подход для анализа совместной функции комплекса мимикрии тРНК, eRF1 / eRF3, в терминации трансляции на рибосоме

Nucleic Acids Res.

2014

42

7851

7866

Conard

с.E.

Бакли

J.

Dang

M.

Bedwell

G.J.

Carter

R.L.

Khass

M.

Bedwell

D.M.

Идентификация остатков eRF1, которые играют критические и дополнительные роли в распознавании стоп-кодонов

РНК

2012

18

1210

1221

Сейт-Неби

А.

Фролова

Л.

Юстесен

Ю.

Киселев

Л.

Факторы терминации трансляции класса 1: инвариантный минидомен GGQ необходим для высвобождения и связывания рибосом, но не для распознавания стоп-кодонов

Nucleic Acids Res.

2001

29

3982

3987

Ченг

Z.

Сайто

К.

Писарев

А.В.

Wada

М.

Писарева

В.П.

Пестова

T.V.

Gajda

M.

Round

A.

Kong

C.

Lim

M.

Структурное понимание eRF3 и распознавание стоп-кодонов eRF1

Genes Dev.

2009

23

1106

1118

Конг

В.

Ito

K.

Walsh

MA

Wada

M.

Liu

Y.

Kumar

S.

Barford

D.

Y.

Song

H.

Кристаллическая структура и функциональный анализ эукариотического фактора высвобождения класса II eRF3 из S.pombe

Мол. ячейка

2004

14

233

245

Алькасар-римский

A.R.

Bolger

T.A.

Венте

S.R.

Контроль экспорта мРНК и терминации трансляции с помощью гексакисфосфата инозита требует специфического взаимодействия с Gle1

J. Biol.Chem.

2010

285

16683

16692

Болджер

Т.А.

Folkmann

A.W.

Tran

E.J.

Венте

S.R.

Фактор экспорта мРНК Gle1 и гексакисфосфат инозита регулируют различные стадии трансляции

Ячейка

2008

134

624

633

Фирчук

H.

Kannambath

S.

Pahle

J.

Claydon

A.

Beynon

R.

Duncan

J.

P.

McCarthy

JE

Контрольная карта in vivo для машины трансляции мРНК эукариот

Мол. Sys. Биол.

2013

9

635

Нойман

Б.

Wu

H.

Hackmann

A.

Krebber

H.

Ядерный экспорт прерибосомных субъединиц требует Dbp5, но не в виде РНК-геликазы, как для экспорта мРНК

PloS One

2016

11

e0149571

Иванов

А.

Михайлова

Т.

Елисеев

Б.

Ерамала

Л.

Соколова

Е.

Сусоров

Д.

Шувалов А.

C.

Алкалаева

E.

PABP усиливает набор факторов высвобождения и останавливает распознавание кодонов во время завершения трансляции

Nucleic Acids Res.

2016

44

7766

7776

Фэн

т.

Ямамото

A.

Wilkins

S.E.

Соколова

E.

Yates

L.A.

Munzel

M.

Singh

P.

Hopkinson

R.J.

Fischer

R.

Cockman

M.E.

Оптимальная терминация трансляции требует C4 лизилгидроксилирования eRF1

Мол. Ячейка

2014

53

645

654

Алкалаева

E.

Елисеев

Б.

Амброгелли

А.

Власов

P.

Кондрашов

F.A.

Gundllapalli

S.

Frolova

L.

Soll

D.

Обрыв трансляции у пирролизин-утилизирующих архей

FEBS Lett.

2009

583

3455

3460

Крючкова

с.

Гришин

А.

Елисеев

Б.

Карягина

А.

Фролова

Л.

Алкалаева

Е.

Двухступенчатая модель распознавания стоп-кодонов эукариотическим фактором высвобождения eRF1

Nucleic Acids Res.

2013

41

4573

4586

Сусоров

Д.

Михайлова

Т.

Иванова

А.

Соколова

Е.

Алкалаева

Е.

Стабилизация терминальных комплексов рибосом эукариот деацилированной тРНК

Nucleic Acids Res.

2015

43

3332

3343

Коричневый

А.

Shao

S.

Murray

J.

Hegde

R.S.

Рамакришнан

V.

Структурная основа распознавания стоп-кодонов у эукариот

Природа

2015

524

493

496

Matheisl

с.

Berninghausen

O.

Becker

T.

Beckmann

R.

Структура терминального комплекса человеческого перевода

Nucleic Acids Res.

2015

43

8615

8626

Ходжа

C.A.

Tran

E.J.

Благородный

К.

Алькасар-Роман

A.R.

Ben-Yishay

R.

Scarcelli

J.J.

Folkmann

A.W.

Shav-Tal

Y.

Wente

S.R.

Коул

C.N.

Цикл Dbp5 в комплексе ядерных пор во время экспорта мРНК I: мутанты dbp5 с дефектами связывания РНК и гидролиза АТФ определяют ключевые этапы для Nup159 и Gle1

Genes Dev.

2011

25

1052

1064

Spahn

C.M.

Гомес-Лоренцо

M.G.

Грассуччи

R.A.

Jorgensen

R.

Andersen

G.R.

Beckmann

R.

Penczek

P.A.

Ballesta

J.P.

Frank

J.

Движения домена фактора элонгации eEF2 и эукариотической 80S рибосомы способствуют транслокации тРНК

EMBO J.

2004

23

1008

1019

© Автор (ы) 2016. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

ПОРТРЕТ ЕКАТЕРИНЫ II | Поместье, музей и сад Хиллвуд

Сделано в: Димитрий Григорьевич Левицкий

В прихожей

Об объекте

Этот монументальный презентационный портрет Екатерины II отражает важную роль портретной живописи в политической, экономической и общественной жизни ее долгого правления.Знаменитые художники и анонимные художники производили множество копий таких портретов, и они развешивались в официальных департаментах, резиденциях губернаторов провинций, образовательных и социальных учреждениях, покровительницей которых была императрица. В этом случае портрет служил вознаграждением за оказанные услуги. Мемориальная доска на оригинальной золотой раме информирует зрителей о том, что в 1788 году императрица подарила этот портрет Генри Хоупу, британскому банкиру, который служил финансовым советником Екатерины.

Картина представляет собой парадный портрет Екатерины II в полный рост. Она изображена в полных государственных регалиях, в белом платье из тафты с плетеными рукавами, отделанными галуном из лавровых листьев и золотой тесьмой, в горностаевом плаще и атласной мантии, расшитой двуглавыми орлами. Екатерина со скипетром в правой руке указывает на бюст Петра Великого в нише позади нее, а также на державу и корону, покоящиеся на бархатном табурете под ним.Девиз «начало совершает» («Завершает начатое») высечен латинскими буквами кириллицы над головой Петра. Поверх горностайной накидки на плечах Екатерины — Андреевский воротник, усыпанный бриллиантами. На ее левой груди красуется звезда Ордена Святого Георгия, а на оранжево-черной полосатой ленте того же ордена висит значок. В правой руке она держит украшенный драгоценностями скипетр. Складки ее мантии накинулись на сиденье тронного кресла с имперским гербом.Справа вверху — драпированные складки малиновой занавески шнурком с кисточками. На золоченой деревянной раме изображен двуглавый орел наверху и четыре провинциальных коронованных герба по углам. Это Казань, Астрахань, Новгород-Волынск, Новгород.

Категория:

картины

Название объекта:

ПОРТРЕТ ЕКАТЕРИНЫ II

Сделано из:

Холст, масло — позолота — металл.

Сделано в:

Россия, Санкт-Петербург

Дата изготовления:

г.1788

Размер:

185,4 × 269,2 см (73 × 106 дюймов)

Подробная информация по этому товару

Каталожный номер:

51,56

Класс:

ЖИВОПИСЬ

Подписных знаков:

НАДПИСИ ДИР PORTRET «VTOROI IMPERATRITSY Екатерины I SAMODERZHITSY POZHALOVAN Всероссийской» EIA IMPERATORSKIM VELICHESTVOM V «1788m GODU OSPODINU Genri Гопу З.А. OKAZANNOE USERDIE ПО DENEZHNYM» NEGOTSIAM «О KAKOVOM POZHALOVANII я UVEDOMLEN» ON «» PIS’MOM 28go Avgusta Tofo 1788go GODA ZA PODPISANIEM «УПОЛНОМОЧЕННЫХ» ДЛЯ ИНОСТРАННЫХ «ЗАИМОВ» МИНИСТРОВ «КНЯЗЬЯ ВЯЗЕМСКАГО ГРАФА ОСТЕРМАНА ГРАФА ШУВАЛОВА И ГРАФА ВОРОНЦОВА Транс:» Этот портрет Екатерины Второй, Императрицы и Самодержца Всея Руси 1788 года подарен Императрицей и Самодержцем Всероссийского Императора.Генрих Надежда на усердие, проявленное в денежных переговорах, о чем ему сообщается письмом от 28 августа 1788 г. за подписями полномочных представителей по иностранному кредиту, министров князя Вяземского, графа Остермана, графа Шувалова и графа Воронцова ». Надпись на раме на металлической пластине кириллицей XVIII в.]

Кредитная линия:

Завещание Марджори Мерривезер Пост, 1973

Уместно в публикации:

«Вкус к великолепию: сокровища русской империи и Европы из музея Хиллвуд», «Музей и сады Хиллвуда: личный музей коллекционера произведений искусства Марджори Мерриуэзер Пост»

Екатерина Шутова

Я доцент Института логики, языка и вычислений (ILLC) Амстердамского университета, где я возглавляю Амстердамскую лабораторию понимания естественного языка.

Ранее я был научным сотрудником Леверхалма в компьютерной лаборатории Кембриджского университета и научным сотрудником Международного института компьютерных наук и Института когнитивных наук и наук о мозге Калифорнийского университета в Беркли. Я получил докторскую степень в компьютерной лаборатории Кембриджского университета и Пембрук-колледже.

Мои исследования находятся в области обработки естественного языка с особым вниманием к вычислительной семантике и машинному обучению на основе лингвистических и мультимодальных данных.Текущие интересы и проекты включают:

• обучение НЛП по несколько шагов

• моделирование подразумеваемых значений и образного языка

• мультимодальная семантика и совместное моделирование языка и зрения

• многоязычное НЛП и лингвистическая типология

• когнитивная обработка и семантическое представление в мозге

• вычислительная социальная наука и социальные приложения НЛП

Мои исследования поддержаны личными грантами Innovate UK, Британской академии и Leverhulme Trust (Великобритания) , а также промышленное финансирование от Google, Facebook и Deloitte.Он также освещался в таких СМИ, как журнал Wired, New Scientist и Economist.

Институт логики, языка и вычислений (ILLC)

Факультет естественных наук

Амстердамский университет

Научный парк 107

1098 XG Amsterdam

0005 9224.46 Телефон 9 : +31 (0) 20 525 8334

Электронная почта: e.shutova @ uva.nl

Балерина, дочь дружка Путина, «зарабатывает 20 МИЛЛИОНОВ фунтов стерлингов в год» в последней теневой сделке, связанной с президентом.

Балерина, дочь одного из Согласно местным сообщениям, ближайшие соратники Владимира Путина зарабатывают почти 20 МИЛЛИОНОВ фунтов стерлингов в год от второго загадочного источника денег.

Мария Шувалова, 22 года, танцовщица всемирно известного Большого балета, работает второй партией в «управлении капитальными активами», которая, как сообщается, приносит ей 75 000 фунтов стерлингов за рабочий день.

6

6

Интернет-сайт новостей BAZA утверждает, что получил утечка ее налоговой отчетности за 2018 год, которая показала, насколько прибыльной была ее вторая роль.

Ошеломляющий доход был в девять раз больше ее годовой зарплаты на балете и больше, чем у руководителей крупнейших российских энергетических и финансовых институтов.

«Мария вполне может претендовать на звание самой богатой балерины России», — сообщает БАЗА.

Авиакомпания Мария — дочь 54-летнего Игоря Шувалова, главы мощной российской государственной корпорации развития ВЭБ.РФ.

Еще в 2018 году он был заместителем премьер-министра Путина. Сообщается, что он оставался близким к кремлевскому лидеру.

BAZA пояснила: «Данные о ее доходах за этот период нам предоставил источник, имеющий доступ к базам данных Федеральной налоговой службы».

«Достоверность информации не вызывает сомнений….

«Самое интересное, откуда Мария Шувалова получила свою космическую зарплату».

Деньги начали поступать на ее банковский счет, когда она танцевала Красную Шапочку в «Спящей красавице», говорится в сообщении.

МАРИЯ НЕ ИЗВЕСТНЫЙ СОТРУДНИК

В ходе расследования СМИ — последней налоговой утечки в отношении элитных россиян в окружении Путина — говорится, что платеж был произведен KSP Capital Asset Management, компанией, связанной с Сергеем Котляренко, который ранее считался адвокатом ее отца.

Компания управляет активами более 600 физических и 19 юридических лиц, говорится в сообщении, но Мария не числится в списке сотрудников.

Нынешний работодатель ее отца, ВЭБ.РФ, российская государственная корпорация развития, настаивал, что он всегда строго соблюдал правила для госслужащих.

Он направил запросы BAZA в KSP.

Компания отрицала, что KSP являлась номинальным владельцем собственности своих богатых клиентов, и что Мария не занимала должности в этой компании.

«Сложно представить, какими компетенциями должна обладать женщина, чтобы получать доход в два миллиарда рублей», — сказал Илья Шуманов, заместитель генерального директора Transparency International в России.

«А с учетом того, что о взаимоотношениях Котляренко и Шувалова давно известно, все это выглядит как вывод денег из компании».

6

6

Русский Tatler отметил, что балерина «хорошо справляется с управлением временем», сумев найти время репетировать в ее плотном графике поездок.

За последние два года молодая женщина по работе побывала в разных странах, включая Кипр, Португалию и Амстердам.

За последний месяц она с удовольствием провела время в роскошной семейной деревне в Дубае.

Когда он был министром, отец Марии долгое время считался самым богатым членом правительства Путина.

В прошлых отчетах говорилось, что он владеет недвижимостью в центре Лондона с видом на Темзу.

В отчете BAZA говорилось о том, может ли Шувалов столкнуться с вопросами по необъяснимым законам Великобритании о богатстве.

«Проверяли ли его британские власти, неизвестно», — говорится в сообщении.

Танцовщица не рассказывала о своем предполагаемом богатстве, но изменила настройки в социальных сетях, чтобы запретить комментарии.

RED HOT

SWING TRAGEDY

FOR THE CHOP

ДЕЙСТВИЕ КЛАССА

« ГОНОЧНОЕ УБИЙСТВО »

ЖУРНАЛ COVID

В одном из постов она сказала ранее: «Я действительно очень устала оправдываться, пытаться вписаться и стесняться…»..

«Я пытался изо всех сил бежать, не имея времени подумать, что мне нужно [или] правы ли люди, которые меня принижают».

Отчет следует за заявлениями заключенного лидера оппозиции Алексея Навального о том, что Путин владеет дворцом на Черном море за 1 миллиард фунтов стерлингов, что Кремль отрицает.

6

6

Njihovi očevi vode Rusiju. Кремля

Фото: Profimedia

Nova generacija elitnih Ruskinja sa očevima na visokim funkcijama — uključujući ministre, članove parlamenta or birokrate u Kremlju — vode multimilionerske poslove, uživaju u luksuznomruži zamaja zamáné žaçión žáná ží.

Privilegije, rukovodeće pozicije, niski bankarski krediti i veliki udeli u kompanijama padaju na čerke Kremlja kao «mana sa neba» (hrana koju je Izraelcima dao Bog u pustinji). One postaju bogate i uspešne, dovodeći ženska lica na vrhunska radna mesta, primećuje Daily beast.

ene ne dospevaju često na vrh biznis or političke piramide u Rusiji kojom dominiraju muškarci, ali veze, посебно близких члановых пород на власти, доле су Рускиньяма karijeru u bankama и пословним корпорация.

Екатерина Тихонова (34) и Мария Воронцова (36), za koje se veruje da su ćerke Vladina Putina , dve najmisterioznije žene у пословном и научном секторе России, vode projekte oddkolžeto mara.

Екатерина Тихонова Фото: Profimedia / Nevar inc / East2West News

Bivša plesačica Tihonova imala je samo 28 година када je preuzela projekat vredan preko 1,5 милиарди долара за развой Научно-техническая парка на Московском државном университете.

Voroncova, endokrinolog, koju ruski mediji često nazivaju «prvom ćerkom», navodno nadgleda program za razvoj genetskih technology sa budžetom više od milijardu dolara.

Мария Воронцова Фото: Profimedia / Телеканал / East2West News

Najmlađa čerka ruskog ministra odbrane Sergeja Šojgua, Ksenija Šojgu (30), prošle nedelje je odlučila da proda svoju uspešnu IT startap kompaniju, koja je prošle godine daradila višle.Она ж 2020. Годин Лансирала фонд «Система СмартТех». Dok njen otac Sergej Šojgu nadgleda jednu od najmoćnijih vojski na svetu, njegova ćerka vodi iznenađujuće javni život: organuje sportske događaje, učestvuje u postimanimmojek.

Ксения Шойгу Фото: Профимедиа / Александр Щербак / ТАСС

Većina other čerki Kremlja drži se dalje od nezavisnih novinara or javnih dogaaja.

— Максимально это средство смею да ураде жесте да присущую годовщину балу коди организационный журнал Tatler — реклама Ана Монгайт, телевизионная водитель за The Daily Beast.

Svake godine ruska elita представляет свою черку на годишнем балу журнала Tatler.

Елисавета Пескова (17), erka portparola Kremlja Дмитрий Пескова, дебитовала je na ovom balu 2015. godine. Леонела Мантурова (23), erka ministra Industrije i trgovine, Дениса Мантурова, prvi put se pojavila na balu 2018, a godinu dana kasnije, unuka bivšeg premijera, Анастасия Черномирдина, imala je svoje prvo predstavljan.

Moskva od 2018. godine govori o ćerki zamenika ruskog premijera, Mariji Šuvalovoj (18), kada je najbogatija balerina Boljšoj teatra započela svoju karijeru i osvojila solo u vr.Pojavljivanje na scene Boljšoja je velika čast, međutim, od baleta je teško zaraditi bogatstvo — prosečna plata kreće se od 500 do 2.500 dolara mesečno.

Мария Шувалова Фото: Instagram / mary.marss

Ne samo da je Marijin otac Игорь Шувалов близко Путину вец двое decenije, он же такой igrao ulogu u nadgledanju ruskog državnog bogatstva od više milijardi dolara. Balerina Poseduje Udeo u kompaniji sa sedištem u Londonu, «Regional Property Developments Limited», kao i elitnu imovinu u Rusiji. Ona putuje širom sveta i pozira na jahti u Dubaiju za potrebe svog Instagram profila. Prema izveštaju sajta Baza, balerina je 2018. zaradila više od 20 miliona dolara.

Iako su ruske čerke ponosne na svoje roditelje, one nemaju hrabrosti da kažu šta misle o politici. Свое время Углавном Не Проводе Правечи Новац на Рекламу на Инстаграму, Его Учестве на Скуповима или Говоречи о Людском Праве, Као Александра Пелоси, Чёрка Предъявителя Представления Дома Нэнси Пелоси.

— Većina ovih mladih žena u dvadesetim i tridesetim godinama nikada ne bi dobile rukovodeće pozicije i velike uloge u poslovnim kompanijama, da nije bilo snažnih veza njihovih očlástlamenta.

Ona dodaje da, ako žele da ostanu bogate i uspešne, moraju da drže usta zatvorena.

— Svaka čerka savršeno dobro shvata da će jednom, kada počne da komentariše korupciju or ljudska prava, njen otac biti u epicentru skandala — istakla je Gudkov.

Međutim, postoje i izuzeci, kao što je Ksenija Sobčak, poznata kao «Путинова кумица», koja je izgradila poslovno i carstvo zabave tokom godina šou-biznisa, mada joj je njeno sозnata koja je njeno sveta. Появляется себе на насловницы водных модных магазинов, позирала я нага док е била трудна за Татлер, и коридоры свои гигантские друзья с прибылью. Televizijska diva takođe posćuje modne revije širom sveta i zarađuje milione dolara na televizijskim projektima i svom restoranskom poslu.

Ксения Собчак Фото: Instagram / xenia_sobchak

На изненаленье свих, Ксения, čiji je otac, градоначельник Санкт-Петербурга, jednom био Путинов шеф, придружила с опозиционом покрэту 2011. и отказала уговоре на државной телевидении.

Снимите это видео, которое снимает вас с Путину, коже познайе од раног детинства, суочавичи так са лидером земли или нечувеной корупции и политическим прогрессом, который идет на спроводили органические реда крем.

Али время отпора Ксения Кремлю это одно прошло. Политические аналитики кажу да е ньена одлука да учествие на председнічкім изборима 2018. белая идея кремля да одрэти пажнью явности од других опозиционих кандидатов. Za Sobčak je glasalo samo 1,6 odsto Rusa. Od tada je njen kritički glas utihnuo, a njen Instagram ponovo bruji od selfija na plaži.

Ксения Собчак Фото: Instagram / xenia_sobchak

Jedna od najmlađih čerki Kremlja, Jelisaveta Peskova, kaže da sebe smatra feministkinjom, ali ne u konfliktnom kalupu.Rekla je da joj se ne sviđaju «muževne žene koje pozivaju na pi ** nje po muškom mišljenju».

Видео: Путинова тайна черка: Kaže da voli što je u centru pažnje

(Телеграф.рс)

Telegraf.